人和老鼠zfy基因产生一个保守的睾丸特异性转录产物编码一小的酸性锌指蛋白并有修饰转活化的潜能课件

Human and mouse ZFY genes produce a conserved testis-specific transcript encoding a zinc finger protein with a short acidic domain and modified transactivation potential,Human Molecular Genetics published March 16, 2012,人和老鼠ZFY基因产生一个保守的睾丸特异性转 录产物编码一小的酸性锌指蛋白并有修饰转活化的潜能,基础兽医2011级 王绪海,Contents,一、背景,1,2,3,在20年前， Zfy从人的 Y染色体分离出来。,在人和鼠中是保守的， 研究集中在胚胎生殖腺,实验目的假设zfy是最初的睾丸决定因子。 SRY,出生后zfy1和zfy2的转录没有完全研究,1.ZFY1和 ZFY2基因,氨基酸94%,睾丸的生殖细胞,减数分裂,产后7-10天,Zfy1和Zfy2基因转录产物,粗线期,RNA FISH,MSCI,二、ZFY基因介绍,带Y染色体的圆精子细胞,Zfy2转录,启动早期表达,Zfy2转录,强的Zfy2转录,x染色体基因CYPT,精子细胞出现并发育,精子特异的启动子,22-24 d.p.p,特异性精子基因家族,Zfy2的外显子,Cypt1,ZFY2基因,ZFY1基因,Zfy1,CYPT启动子上游拷贝,no,转录产物存在精子细胞还有待确定,2. 老鼠的ZFY基因,生殖细胞进入减数分裂,减数分裂的粗线期,精子细胞中强烈激活,性染色体异常精母细胞凋亡,外显子大约编码一半的酸性链,转录逐步增加,MSCI,转录产物在精子占优势,比MSCI占优势,ZFY1和 ZFY2基因,Zfy2,Zfy1 转录产物,沉默,小鼠Zfy基因,1.3 Mb Sxrb缺失,在鼠Y短臂来源的性逆转因子的 Tp(Y)1 CtSxr-a(16),Zfy2和Zfy1基因 不合理的重组之间,转录的Zfy2/1 融合基因,启动子区域5UTR,第一编码Zfy2 外显子,内含子5到其余六个 Zfy1外显子编码,Zfy1编码区域 控制在Zfy2启动子之下,难以估计缺失对 ZFY功能的影响。,ZFY在两种不同雄性类型的 性染色体参与消除精母细胞凋亡,1.Zfy1和Zfy2的错误表达,Zfy1和Zfy2都可以在正常雄性被沉默,2.Zfy2,XYY雄性鼠消除精母细胞在粗线期中期阶段的凋亡,两个Y染色体形成突起,第一次减数中期(MI)有效消除精母细胞凋亡,逃避沉默,应答一个附在拟常染色体区(PAR)的X染色体 X单叶雄性XSxraO携带性逆转因子Tp(Y)1 Ct Sxr-a,3.人的ZFY基因,单一的ZFY基因转录,睾丸中的作用,人类生殖细胞发育或 男性生育能力的作用,为进一步了解近乎相同的Zfy1和Zfy2基因,在X单价染色体在减数分裂中期细胞凋亡,有关的反应功能差异的基础,分析了Zfy转录在老鼠精子形成,Zfy复合物，涉及多个转录剪接变体,重新评估ZFY转录产物在我们已经确认人类特异性睾丸剪接变体,小鼠结构上同源的主要Zfy1多种转录产物,三、结果,1.Zfy1和Zfy2在早期的精母细胞和圆的精子细胞转录 当核酸进入转录用RNA FISH鉴别初期转录产物,支持细胞或其他细胞 精原细胞B,RNA FISH鉴别 初期转录产物,核酸进入转录,A精原细胞核杂交信号弱,Zfy1和Zfy2信号,细线期,强信号,偶线期的细胞核,粗线期的细胞核,Zfy基因被MSCI沉默,减数分裂 性染色质,圆精子,Zfy2转录,Zfy1转录,Zfy2信号的精子细胞,精子细胞 强大的Cypt启动子,Zfy2和Zfy1,精母细胞中的转录,比MSCI开始早,精子细胞中都被活化,结果2 5UTRs和假定的 老鼠Zfy基因启动子,提取RNA,定性和定量 相结合的RT-PCR,3和7d.p.p。(只有精原细胞),10,16和20d.p.p(只有精原细胞和精母细胞),27 d.p.p.和性成熟的 (精原细胞、精母细胞和精子细胞),Zfy外显子是屈指可数的,结果2 5UTRs和假定的 老鼠Zfy基因启动子,RNA FISH鉴定Zfy1和Zfy2的弱信号,鉴定转录 产物,不同启动子可能的作用,A型精原细胞,Zfy1 外显子1b,Zfy2外显子1a或1b 一直到外显子5,7d.p.p,2. 5UTRs推断的老鼠Zfy基因启动子,7和16 d.p.p,早期减数分裂阶段 在MSCI开始前启动,Zfy1和Zfy2转录 产物包括1 b外显子,1a的Zfy2,特定的精子细胞Cypt启动子,定量PCR证实,Zfy2-a水平只有在睾丸精子细胞(Cypt)是很强的(27和50 d.p.p)。 在精母细胞出现和发育时，Zfy1-b和Zfy2-b在7-20 d.p.p.增加。Zfy1-b水平随着精子细胞的出现继续增长(27 d.p.p)，显示Zfy1 在精子细胞中被重新激活。 而Zfy2-b在16至50d.p.p水平保持不变。表明Zfy2的启动子Zfy在Zfy1的精子细胞被激活并不强。,2. 5UTRs推断的老鼠Zfy基因启动子,Zfy2,两个Zfy基因 5UTRs,被不同的启动子转录,Cypt,Zfy1启动子和5UTR,Zfy 1同源的启动子和5UTR,3.各种老鼠Zfy转录产物编码区,Zfy1,500bp,pre-MSCI Zfy1产物,552bp外显子6,编码一半的酸性链,Zfy2,全部的外显子6,两个最强较小的Zfy2产物,900bp,成对的，111bp或123bp,3.各种老鼠Zfy转录产物编码区,27dpp,16 d.p.p,Zfy1转录产物缺少外显子6,Zfy2转录产物有外显子 6,20-27 d.p.p，增加4倍,qPCR,Zfy1，20 d.p.p，外显子6,生殖细胞进入精子 产生阶段一致,没有外显子6的Zfy1转录产物浓度 16和20 d.p.p 高峰， 比精子细胞先发育,zfy转录比(MSCI)先开始，特异拼接的外显子6 ， 两个亚型Zfy酸性蛋白亚型。 Zfy1转录产物的数量在精子有外显子6时增加， 在没有外显子6时对精母细胞是特异性的,Cypt,活性的,精母细胞,有外显子6的Zfy2转录产物,10 和20 d.p.p.,20和27 d.p.p,20和27 d.p.p,精子减数分裂在睾丸出现和发育,Zfy2转录产物水平在7和20 d.p.p.很低,Cypt,活性的,有外显子6的Zfy2转录产物,没有外显子6的Zfy2转录产物,4.老鼠zfy转录产物polyA作用位点,Zfy1使用两种polyA位点,Zfy2使用标准的AATAAA polyA信号,zfy1却没有,Zfy2上游站点，Cypt转录产物,下游位点(3UTR284bp)为其pre-MSCI转录产物,Zfy2也使用了两个polyA位点,Zfy2 3RACE产物在基因组（dA14),4.老鼠zfy转录产物polyA作用位点,Y/N 外显子6片段,Zfy1和Zfy2,外显子5到11的特异性引物,每个3UTR,Zfy1或Zfy2有没有外显子6与特定3UTR没有关系,4.老鼠zfy转录产物polyA作用位点,RT-qPCR,Zfy1的3RACE 结果(图4A),在27-50 d.p.p短3UTR的产物， 相对于在7和16 d.p.p中间的3UTR产物,显示强。,当观察到Zfy2时，在精子细胞中 Zfy1小polyA位点的作用可能增强。,没有证据证明ZFY polyA选择 是通过一个保守的机制取得的,5.在Zfy2/1融合基因内Sxr b断点缺失,确切的断点,导致新一代的 Zfy2/1融合基因产生,不平等的Zfy1的内含子5 (20 705 bp) 和 Zfy2的内含子5 (内11 556bp) 交流之间,Sxr b缺失,Zfy1和Zfy2 特异性的STS标记,定位断点,插入，内含子5选择性 处理拼接的外显子6,Sxrb连接片段,Sxrb缺失通过一个不合理的跨越事件 发生在Zfy1和Zfy2相同的95bp之间,5.在Zfy2/1融合基因内Sxr b断点缺失,5.在Zfy2/1融合基因内Sxr b断点缺失,Sxrb连接片段用 PCR RFLP实验被证实,特定的RsaI片段,广泛的培育试验,筛选工具,Sxrb区间,XYSxrb载体的雄性鼠,6. Zfy2/1融合基因 在载体Sxrb老鼠中的转录产物,Sxrb缺失Zfy表达,RT-PCR,早期和晚期Zfy2/1 融合基因转录产物,XESxrb O(只有Zfy2/1基因),XYSxr b(有Zfy1, Zfy2和Zfy2/1基因)小鼠,外显子6的有无,间期次级精母细胞比 第二次减数分裂先中断,有完整的精子产生,有漏洞的,30-60d.p.p.不正常的 精子出现在睾丸小管,6. Zfy2/1融合基因 在载体Sxrb老鼠中的转录产物,早期10 - 21 d.p.p。 晚期27 - 73d.p.p。,Zfy2的外显子5和 Zfy1的外显子10特异引物,XYSxr b和XESxrb O 睾丸Zfy2/1融合基因,两个阶段都有 Zfy2/1转录产物,正常的XY雄性鼠,6. Zfy2/1融合基因 在载体Sxrb老鼠中的转录产物,早期阶段,没有外显子6的转录产物占优势,融合基因在 精母细胞被拼接,Zfy1,Zfy1和Zfy2/1的相似性 在后期表明这一情况在精子,XESxrb O,外显子1a或1b和外显子5 引物扩增Zfy2/1基因,融合基因是两个 Zfy2启动子转录的,6. Zfy2/1融合基因 在载体Sxrb老鼠中的转录产物,zfy2外显子1a转录产物 (Cypt)在早期就没有发现,用外显子1a和6引物最先在 成熟的XYSxrb小鼠中检测到,Cypt启动子驱动的转录产物很容易在 出生30后XESxrbo雄性睾丸中发现,没有发现精子,6. Zfy2/1融合基因 在载体Sxrb老鼠中的转录产物,XESxrbo老鼠精子,活性的特异性精子Cypt 启动子继续逃脱次级精母细胞,XYSxrb雄性鼠,Zfy2/1融合基因,Zfy1的外显子6 在精子中是怎么样拼接,特定Zfy2的外显子1a引物 和Zfy1的外显子8,有与无6外显子,扩增Zfy2/1 融合基因转录产物,剪接出外显子6发生 在精子细胞和精母细胞,6. Zfy2/1融合基因 在载体Sxrb老鼠中的转录产物,3RACE分析,Zfy2/1融合基因转录产物优先 使用标准的AATAAA polyA信号,而不是用精子细胞Zfy2上游AATATAAA信号,除了Zfy2编码区域的缺失,Sxrb 缺失最主要的结果,Zfy重组基因的表达,在精子和精母细胞中是一个较低的 转录水平编码全长的Zfy酸性链,7.人体特异性睾丸zfy转录产物 编码一个短的酸性域,老鼠zfy1 基因外显子6,人zfy基因外显子3,zfy调节在人和鼠 之间调节差异很大,外显子2和4 引物进行RT-PCR,缺乏外显子3 的转录产物,老鼠，外显子3是第二编码外显子。 它长573 bp，编码大约一半的zfy激活域,8.在人减数分裂成熟期 捕获特异性睾丸的zfy转录产物,减数分裂,人的zfy转录产物 缺乏外显子3被表达,组织学决定 减数分裂成熟捕获方法,两个缺乏精子的男性 睾丸内活体检测了它的表达,Ste-363,Y染色体的AZFb间隔缺失,粗线期中断,Apop12,细线期到偶线期,NO Y染色体缺失有早期中断,外显子2和4引物进行RT-PCR检测,zfy转录产物 有没有外显子3的表达,8.在人减数分裂成熟期 捕获特异性睾丸的zfy转录产物,PRM1 and TNP1，特异性,生殖细胞减数分裂后的缺失,HPRT基因作为阳性对照,精子标记PRM1或TNP1缺失,zfy转录产物有 没有外显子3的存在,8.在人减数分裂成熟期 捕获特异性睾丸的zfy转录产物,缺乏573bp的外显子3,生殖细胞,老鼠的Zfy1,人的zfy产生转录产物比MSCI先开始,9.zfy转录产物呈现在人精子,有和没有外显子3 转录产物的特异性重组引物,在精子RNA中 都检测到转录产物,zfy转录停止,组蛋白从核染色质移除并且精子延长时,RT-PCR,整个睾丸,主要的zfy转录 产物没有外显子3,10.zfy蛋白短的酸性域不会激活转录,酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）激活转录,Zfy2和Zfx酸性域能够融合到DNA相关的Gal4转录激活因子域,酵母Y187菌株,LacZ(b-galactosidase)基因,Gal4 GAL1启动子,10.zfy蛋白短的酸性域不会激活转录,ZFY, Zfy2和Zfy1长的酸性域 编码激活的乳糖产生像Gal4的酸性域,抗高表达克隆筛选的结果,四、讨论,讨论一,讨论二,讨论三,在人类和老鼠不同ZFY基因结合,短的酸性链功能,Zfy1和Zfy2在中期凋亡应答 在X单价染色体的功能差异,Zfy1功能,讨论四,讨论五,Zfy1和Zfy2在IV阶段精母细胞阻断,讨论六,从人的角度看Zfy1 / Zfy2适应,讨论七,ZFY和人的生育力,讨论一 在人和老鼠不同特异性ZFY基因结合,老鼠 ZFY1和人ZFY,不同的拼接,第二编码外显子分离,ZFX转录产物第二编码,ZFY蛋白全长的四分之一和一半的酸性链,幼生淋巴细胞株,小鼠或人 ZFX转录产物没有被发现,全部zfx酸性链在睾丸中占优势,Zfx转录产物缺乏150个核苷酸第3编码外显子,Zfa逆基因,特定的zfy转录产物的一种特异性适应,讨论二 短的酸性链功能,老鼠ZFY2和ZFX酸性链在酵母激活转录,ZFY蛋白质,负电荷的酸性链之间的相互作用,调节或转录机制,基因组特定的位置,Gal4,组蛋白乙酰转移酶(HAT)和TATA 相关的蛋白质的靶基因启动子区域激活转录,Gal4酸性链和Tra1酸性蛋白的直接相互作用,讨论二 短的酸性链功能,Tra1,ATM超家族,真核生物的进化，保守的,同系物是TRRAP(变换/转录相关蛋白链),HAT复合物,转录、复制和DNA修复,反复利用TRRAP补充到染色质,长的ZFY基本模型,TRRAP复合物到特定位点,短的ZFY,183个氨基酸酸性域和32净电荷,讨论三 Zfy1和Zfy2在中期凋亡应答 在X单价染色体的功能差异,Zfy1和Zfy2在精母细胞功能不同,消除单叶X染色体的中期精母细胞凋亡需要Zfy2,中期凋亡对不成双的XESxrb染色体的应答,启动子、5UTR和来源于Zfy2的第一编码外显子,编码区有关(46氨基酸编码差异)或与3UTR有关,Zfy1，缺乏 外显子6的转录产物,讨论三 Zfy1和Zfy2在中期凋亡应答 在X单价染色体的功能差异,外显子6编码的酸性链,部分ZFY1和ZFY2的反式激活活性,缺失外显子6(183个氨基酸),Zfy1和Zfy2功能不同的基础,对一个单叶X染色体的应答,酸性链的ZFY蛋白能够利用 包含TRRAP复合物到达染色质,？中期凋亡 的增强作用,讨论四 Zfy1功能,XSxraO(Zfy1和Zfy2)和XEZ2O+Sry-tg(只有Zfy2),XEZ1u0+Sry-tg(只有Zfy1)和XE0+Sry-tg (没有Zfy基因),第一次减数分裂前期,对Zfy1基因 相关的任何影响,Zfy1、zfy蛋白质和ZFY短酸性链在减数分裂中的作用？,讨论四 Zfy1功能,Zfy1和Zfy2锌指域的进化都受到限制,选择的功能,一个ZFY转录产物编码一个短酸性链,短的ZFY亚型和鼠Zfy1在精子形成中起保护作用,同样DNA的目标,Zfy2和Zfy1之间的有46个氨基酸差异和34个 在363个氨基酸酸性链,只有4个定位到372个氨基酸锌指域,不含在Zfy2第三锌指的特异性老鼠的六个氨基酸缺失,讨论四 Zfy1功能,在(MSCI)后精母细胞ZFY1持续的转录 ZFY1蛋白在早期精母细胞被翻译,可以参与中期凋亡应答的调节，或者通过 对抗ZFY2连接到它的靶基因减少正常XY精母细胞的凋亡,缺乏非突触染色体的中期凋亡,对精母细胞的发育有轻微的影响、 提高精子生成过程的效率或保真度,ZFY1抗凋亡的效果,雄性小鼠缺乏ZFY1,表达Zfy2,结果3 讨论五 Zfy1和Zfy2在IV阶段的精母细胞阻断,Zfy1和Zfy2在这一阶段拥有 相同的作用方式，促进凋亡的能力不同,MSCI ，Zfy基因的持续表达导致中粗线期中断,高度相似的ZFY1和ZFY2锌指蛋白域,相同的启动子域，并 减少与其他转录因子相通的结果,部分Zfy1转录产物编码全长酸性链