动物实验技术5免疫缺陷动物课件

n第一节 实验动物免疫特点 n第二节 实验动物免疫基因系统 n第三节 免疫缺陷动物的分类 n第四节 T淋巴细胞缺陷动物 n第五节 联合免疫缺陷动物 n第六节 其它免疫缺陷动物 第九章 免疫缺陷动物 第一节 实验动物免疫特点 n免疫系统种系发生 n 动物 细胞 淋巴器官 免疫反应 n 分类 名称 淋巴细胞 浆细胞 胸腺 脾脏 细胞免疫 体液免疫 n IgM IgG IgA IgE IgD n 圆口类 鳗 + - + - - + - - - - n 鱼类 油鲛 + - + + - + - - - - n 鲤鱼 + + + + - + - - - - n 两栖类 蝾螈 + + + + - + - - - - n 青蛙 + + + + + + + - - - n 爬行类 龟、蛇 + + + + ？ + + - - - n 鸟类 鸡 + + + + + + + + - - n 哺乳类 鼠、人 + + + + + + + + + + n n无脊椎动物仅为原始的细胞吞噬作用 n抗体从母体到幼体的传递 1、存在两种传递方式： 出生前在胎盘、卵黄囊或羊膜内完成。 出生后从初乳获得。 动物 胎盘类型 转移途径 抗体转移 转移时间 出生前 出生后 小鼠 血性绒毛膜 肠（主要） 卵黄囊 + + 妊娠到17d 大鼠 血性绒毛膜 肠（主要） 卵黄囊 + + 妊娠到20d 豚鼠 血性绒毛膜 卵黄囊（主要） 肠 + + 妊娠到2d 兔 血性绒毛膜 卵黄囊 + - 妊娠到15d 灵长类 血性绒毛膜 胎盘 + - 妊娠到3个月 犬 内皮绒毛膜 肠 - + 出生到8d 2、IgE和IgA在母子传递中不进入体液循环，IgM只在出生 后传递。 3、大、小鼠、豚鼠、兔、猴，幼仔血清中母源抗体效价高 于母体。 4、大、小鼠、犬、猫、兔、猴，从妊娠期抗体开始向胎儿 移行，更多以母乳转移。 一、小鼠 n 能诱发速发型变态反应,全身性过敏反应表现为循环性虚 脱，动物几小时内死亡。 n 小鼠IgE、IgG能使皮肤致敏，引起真皮过敏反应。 n 近交系小鼠的免疫反应多由常染色体上的免疫反应( immune response , Ir )基因控制，Ir基因与H-2(主要组 织相容性位点)相连接，与T细胞功能密切相关。 n Ir基因具有常染色体显性特征，定位于MHC区域，它决 定一个特定氨基酸聚合体是否能引起抗体的产生。 n 每一Ir基因编码一个MHC分子的一个特定等位形式。 二、大鼠 蠕虫感染能诱发大量IgE抗体，但常规免疫只能使大鼠 产生少量，且体内存在时间较短。 大鼠对炎症反应敏感，特别是踝关节。但遗传背景、机 体免疫状态可影响发病率。 三、豚鼠 豚鼠用于结核菌素的皮内试验和接触过敏物质的迟发型 变态反应，但与人有差别。 豚鼠有两种变态反应抗体：IgG1和IgG2。 13系和2系迟发型变态反应能力不同。 13系和2系对特异性抗原产生的免疫反应不同。 四、兔 兔用于制备高效价、特异性强的免疫血清，但因品种、 个体不同而产生不同效价的抗体。 IgM增强IgE的形成，IgG抑制IgE的生成。IgE与IgG引 起过敏反应征状相似。 肠道淋巴组织由派伊尔氏淋巴集结、圆囊和阑尾构成。 五、犬 在犬花粉病和蠕虫感染中，由IgE介导。 新生犬初次免疫抗体全为IgM，再次免疫能产生与成年 犬相同的IgM、IgG。 Beagle犬的循环T淋巴细胞对PHA的反应随年龄而变化， 高峰在6Ws-6Ws。 六、猪 初乳中主要为IgG，其次为IgA。 猪IgA与人有交叉反应。 肠道固有层含有分泌IgA的浆细胞。 七、羊 初乳与常乳中主要免疫球蛋白为IG1。 山羊是制备IG的良好动物。 绵羊红细胞用于补体结合反应。 八、猴 新大陆猴无IgA。 旧大陆猴有IgE。 新大陆狨猴有免疫耐受。 第二节 实验动物的免疫基因系统 一、小鼠移植抗原一、小鼠移植抗原 George Snell George Snell采用近交系，通过分析移植肿瘤和采用近交系，通过分析移植肿瘤和 其他组织的排斥反应首先发现其他组织的排斥反应首先发现H-2H-2。 20 20年后，年后，BarujBaruj BenacerrafBenacerraf提出不同近交系对简提出不同近交系对简 单多肽抗原的应答中产生抗体，控制这类免疫应答单多肽抗原的应答中产生抗体，控制这类免疫应答 的基因称为的基因称为IrIr基因（基因（immune response geneimmune response gene）该基因）该基因 定位于定位于MHCMHC区域，区域， 1、小鼠H-2符号表示 近交系小鼠H-2等位基因采用小写字母。 与小鼠移植排斥反应有关的两个最重要的H -2基因座是H-2K和H-2D。 K基因首先发现于MHC标示为k的种系；D基 因发现于MHC标示为d的种系。故在k型MHC的种 系中，其k等位基因被称为Kk，亦简称为H-2k； 而在MHC为d的种系中被称为Kd，亦简称为H-2d。 K、D、L三个位点均为MHC的I类基因。 2、小鼠H-2抗原的分布密度 脾脏为最高； 其次为肝、淋巴结、胸腺； 再次，以肺、肾上腺、肾脏的顺序递减。 3、近交系和杂交小鼠异体移植的一般规律 供 体受 体接受或排斥 近交系(同性别别 ) 同一近交系接受 近交系其他近交系排斥 近交系本近交系与另一近交系交配生产产的杂杂交 一代(n) 接受 近交系同一近交系排斥 近交系同一近交系排斥 杂杂交一代杂杂交一代的亲亲本近交系排斥 由此可见，MHC基因产物是基因共显性表达的结果。 三、小鼠单倍型 1、MHC单倍型 单倍型指染色体上的一组可以共同一道遗传的 MHC等位基因。 不同的重组株在H-2内的一些基因位点具有不同 的等位基因，即H-2单体型不同。 H-2单倍型不同，免疫反应有明显差异。 所有杂合子个体均有两个MHC单倍型，近交系 小鼠只有一个单倍型。 常用近交系小鼠H-2复合体的单倍型 近交系单单倍型H-2复合体 K A E S D C57BL/6C5 7BL/10 H-2bb b-b b BLAB/CDB A/2 H-2dd d d d d AKR/CBA/ C3H H-2kk k k k k SWRH-2qq q q q q SJLH-2sss-ss 2、MHC重组体 在MHC系统中可发生基因重组。 重组体等位基因的命名可按产生重组体的原始近交系小 鼠而定。 选用不同单倍体小鼠，对特定抗原应答性反应进行研究 ，发现小鼠有类似针对合成分枝多肽(T,G)-A-L抗原的 基因(Ir-1)与MHC存在着连锁关系 H-2重组体的单倍型 重组组体单单倍 型 原始纯纯系小 鼠单单倍型 H-2复合体 KAESD B10.Aak/dkkkdd B10.HTGgd/bddddd B10.A(2R)h2a/bkkkdd B10.A(3R)i3b/abbkdd B10.A(4R)h4a/bkkbbb B10.A(5R)i5b/abbkdd B10.AKMmk/qkkkkq 第三节 免疫缺陷动物的分类 n免疫缺陷动物（immunodeficient animal）: 指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种 免疫免疫系统组成成分缺陷的动物。 n先天性免疫缺陷动物： lT淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠（nude mice）、裸 大鼠(nude rat)。 lB淋巴细胞功能缺陷动物：性连锁免疫缺陷小鼠（ CBA/N）。 lNK淋巴细胞功能缺陷动物：Beige小鼠。 l联合免疫缺陷动物：严重联合免疫缺陷小鼠(SCID mice)、虫蛙小鼠(motheaten mice)。 l其它免疫缺陷动物：显性半肢畸形小鼠(dominant hemimelia mice)。 n获得性免疫缺陷动物： l小鼠AIDS模型：SCID小鼠AIDS模型、AIDS的转 基因小鼠。 l猴AIDS模型：反转录病毒诱发、SIV诱发。 l有蹄动物慢病毒感染。 l黑猩猩HIV感染。 第四节 T淋巴细胞功能缺陷动物 一、 裸小鼠（nude mice）： 即先天性无胸腺裸小鼠，由11号染色体上nu隐 性基因突变导致。 该基因已回交到不同品系，包括： NIH-nu/nu、BALB/c-nu/nu 、C3H-nu/nu 、C57BL/6- nu/nu。 被毛生长异常，呈裸体外表。 无胸腺，仅有胸腺残迹或异常胸腺上皮，不 能使T-cell正常分化，导致细胞免疫力低下。 幼龄鼠有残存的未分化的上皮细胞。 B细胞功能正常，NK细胞活力增强。 繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子 与雌性杂合子繁育。 T细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞 或正常胸腺上皮得到校正。 二、裸大鼠(nude rat)： 基因符号为rnu，一般特征似裸小鼠。 发育迟缓，体重为正常大鼠的70%。 裸大鼠较裸小鼠对多种传染病更敏感。 比裸小鼠更强壮、寿命更长。 体型较大，对大范围的外科手术方法较有利。 三、裸鼠的肿瘤学特性 1. 人类肿瘤的裸鼠移植 1) 人癌组织（手术标本）移植： a.手术标本移植成功率28.3%，其中复发性肿瘤 50%，转移性肿瘤38.5%，原发瘤20.5%。 b.黑色素瘤和结肠癌移植成功率最高，乳腺和淋 巴网状内皮细胞肿瘤成功率低。 c. 女性生殖系统肿瘤和结肠癌生长最快，胚胎性 和骨的肿瘤生长慢。 2) 肿瘤细胞株移植： a.肿瘤细胞株移植成功率高于人癌手术标本。 2. 宿主和肿瘤特性对裸鼠移植瘤生长的影响 1) 裸鼠遗传背景：裸鼠遗传背景对肿瘤生长有一定影响。 2) 移植部位和途径： a.皮下移植易于观察肿瘤生长状况，部位多在背部靠头部 皮下，或腋下（因其血管丰富，利于肿瘤生长，且不影 响动物的活动）。 b.移植部位和途径可影响移植瘤的生物学特性：皮下接种 一般不发生肿瘤浸润和转移；腹腔内接种则显示癌细胞 恶性行为。 3) 人为改变裸鼠免疫功能： a.采用免疫抑制、放射照射可提高移植瘤成功率， 包括难以移植成功的肿瘤。 4) 人类肿瘤细胞的本身特征： a.分化程度低移植成功率高，恶性程度与移植成功 率呈正相关。 5) 激素和宿主性别的影响： a.激素依赖性肿瘤，如乳腺癌、子宫、肺及骨的肿瘤 ，在裸鼠中最难成功。 b.裸鼠的性别和激素水平直接影响裸鼠移植瘤。 3. 裸鼠移植瘤组织学特征及稳定性 1) 人癌在裸鼠体内形成移植瘤后，仍保留原发肿瘤的 一般特点。如：病理组织结构、超微结构、染色体特 征、肿瘤标记物等。 2) 部分人类肿瘤移植后，表现一个或几个肿瘤细胞亚群 的选择性生长，造成起源于同一原发瘤的细胞在生物 学性状表现一定的异质性；且出现于裸鼠移植中的肿 瘤细胞亚群也不一定都能在人体原发肿瘤中发现。 4. 宿主对移植瘤的反应和间质改变 1) 恶性肿瘤作为细胞悬液或组织块移植到宿主裸鼠, 宿主与肿瘤相互作用，间质反应随之发生，由宿主 产生新的移植瘤间质，如血管床、纤维架。 2) 间质改变引起癌细胞分化程度的差异，分化程度改 变多发生于裸鼠第一次传代。 5. 移植瘤的转移 1) 肿瘤分化程度：肿瘤分化程度越低，浸润转移越 明显，转移发生越早。 2) 接种途径与部位：腹腔接种一般转移率高于皮下， 常位接种转移更接近于原肿瘤在人体内转移的情况 。 3) 环境因素：SPF环境中带瘤裸鼠淋巴结比普通环境 转移率高、转移快。 4) 宿主状态：遗传背景、周龄、饲养条件及免疫状态 直接影响肿瘤转移的发生。 第五节 联合免疫缺陷动物 一、严重联合免疫缺陷小鼠(SCID mice) 1983年由美国Fox chase癌症中心于C.B-17Icr近交 系中发现，突变基因scid位于16号染色体。 l该突变基因造成编码Ig重链和TCR的基因重排异常， 抑制B-cell和T-cell前体的正常分化。 lC.B-17Icr为携带来自C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重 链Igh-1b等位基因的 BALB/cAnIcr的同源近交系。 l纯合子血清中无免疫球蛋白，淋巴结、胸腺变小，缺 乏体液、细胞免疫功能。饲养于SPF环境中。 lSCID小鼠的渗漏现象。 l在严格的SPF环境中，SCID小鼠可存活1年以上 二、scid-hu小鼠 通过移植人免疫组织或免疫细胞，可使SCID小鼠 具有人类部分免疫系统，称为SCID-hu小鼠。 1. SCID-hu免疫重建的机制: lSCID小鼠体内T、B细胞自身不能分化成特异性淋巴 细胞，但小鼠体内淋巴细胞分化的微环境正常，能接 受人体正常组织的移植成为嵌合体小鼠。 l1988年Mosier首次将人外周血淋巴细胞及人胎肝移植 于SCID小鼠的皮下和肾包膜下获得免疫重建的成功 。 l目前已有人胚胎组织如骨髓、胸腺、肝、淋巴结，成 年人外周血淋巴细胞、骨髓、脾进行移植。 l由于成年人外周血淋巴细胞比人胚胎组织、脾更易获 得，PBL-hu-SCID模型研究更多。 lPBL-hu-SCID小鼠脾检出的人淋巴细胞达80-90%， 移植6个月后，80%小鼠可从外周血中检出人淋巴细 胞。 2. SCID-hu存在的问题: 1) 重建成功率达不到100%，不同实验室研究结果以及同 一实验室不同小鼠个体间免疫重建的程度存在明显差异。 2) SCID小鼠体内淋巴细胞的功能不能标准化。 3) 不同类型淋巴细胞组成的移植物移植于SCID小鼠，T细 胞易获得免疫重建，活性B细胞数目有限。 4) 易发生移植物抗宿主反应导致小鼠死亡。 5) 免疫重建方法不尽统一，效果不同，影响该模型的标准化 及重复性。 三、虫蛙小鼠(motheaten mice) 1965年发现于C57BL/6J的突变，突变基因me位于第6号染色 体，寿命不超过8周。 l 出生后2天内出现皮肤脓肿，有严重联合免疫缺陷。 l 对胸腺依赖和非依赖抗原均无反应。 l 对T、B细胞分裂素的增殖反应严重受损。 l 细胞毒细胞和NK细胞活性低。 l 伴有自身免疫的倾向，免疫复合物沉积于肾、肺、皮肤。 l C57BL/6J-me在1-2日龄表皮可见嗜中性白细胞集聚，表皮色素 呈斑点状，故称虫蛙小