三七不同部位及总皂苷提取物的hplc指纹图谱研究

三七不同部位及总皂苷提取物的 HPLC 指纹图谱研究 崔翰明，张秋燕，彭 亮，路文龙，王 阶 * 中国中医科学院广安门医院（北京市宣武区北线阁 5 号，100053） 摘要：目的 建立三七不同部位及总皂苷提取物的 HPLC 指纹图谱分析方法。方法 三七不同 药用部位（主根、筋条、剪口、叶、花）和不同规格（20-100 头）及总皂苷提取物采用甲醇 提取，RP-HPLC/UV 法测定，Kromasil C18（250mm4.6mm ，5m ）色谱柱；乙腈和水 （v/v）线性梯度洗脱；流速： 1mLmin-1；柱温：30；检测波长：203nm；进样量： 20L。结果 三七在 80min 的色谱图中共确定 17 个特征峰，主要峰分离良好，经对照品和 HPLC/MS 判定峰 4 为三七皂苷 R1、峰 5 为人参皂苷 Rg1 和 Re、峰 6 为 Rf、峰 7 为 Rb1、峰 8 为 Rc、峰 9 为 Rb2、峰 10 为 Rb3、峰 11 为 Rd。以峰 4 为参照峰（S ） ，计算 17 个特征 峰的相对保留时间和相对峰面积比，各峰精密度、稳定性和测定重现性 RSD 均小于 6.47。 通过相似度软件评价，不同规格三七根（20-100 头）和剪口、筋条的指纹图谱近似，相似度 大于 0.971，但三七根和根茎与花和叶差异很大，相似度分别为 0.596 和 0.564。三七总皂苷 提取物因药用部位及生产工艺不同，其主要特征峰的峰面积及比例存在较大差异。结论 本 方法简便、准确，重现性良好，可用于准确分辨三七不同药用部位及其总皂苷提取物的质量。 关键词：三七；高效液相色谱；指纹图谱；三七总皂苷 Study on the fingerprint of different part of Panax Notoginseng and total saponins by HPLC CUI Han-ming, ZHANG Qiu-yan, PENG Liang, LU Wen-long, Wang Jie * Guanganmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science; Beijing 100053,China Abstract: Objective: To establish an analysis method of HPLC fingerprint of the different part of Panax Notoginseng and its total saponins. Method: The different part (including root, rhizome, branch root, leaf, flower) and different specifications of (20-100 pieces per 500g) Panax Notoginseng and its total saponins were extracted with methanol. The HPLC conditions were as following: Kromasil C18 column (2504.6mm，5m), acetonitrile and water linearity gradient elution, flow rate at 1.0mLmin-1, column temperature at 30, wavelength 203nm, injection 20L. Result: The primary peaks in 80min HPLC chromatogram of the different part of Panax Notoginseng were well separated. The 4th，5th ，6th，7th，8th，9th ，10th，11th peak were identified as Notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1 and Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rd by control sample and HPLC/MS technique, respectively. 17 character peaks were selected as the fingerprint peaks of Panax Notoginseng. The relative retain time and relative area of 17 peaks were calculated by taking Notoginsenoside R1 peak(4th) as the referential peak. The RSDs of precise and stability and repeatability were less than 6.47%. The similarities of fingerprints were evaluated by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM. The similarities of the roots (20-100 pieces per 500g) and rhizome and branch root of Panax Notoginseng were greater than 0.971, but the similarities of the root and flower and leaf of Panax Notoginseng were 0.596 and 0.564, respectively. For total saponins of Panax Notoginseng were extracted from different parts and productions，the area and ratio of its character peaks were quite different. Conclusion： The method is simple, accurate and repeat, and can be applied in the quality control of the different part and total saponins of Panax Notoginseng. Key words: Panax Notoginseng；HPLC；Fingerprint；Total saponins； 国家自然科学基金重大项目（90209011） ，国家重大新药创制专项（2009ZX09103-355 ）资助 通讯作者：王阶，电话；E-mail ： 作者简介：崔翰明，1972.10，药学硕士，主要从事中药新剂型和质量标准研究，电话： 2010-88001470 ；E-mail ： 三七为五加科 Araliaceae 人参属 Panax 植物三七 Panax notoginsng (Burk) F.H.Chen。始载 于本草纲目 ，主产于我国云南、广西等省，功能散瘀止血、消肿定痛，为临床常用中药。 三七的主要有效成分为三七总皂苷，具有扩张血管，降低心肌耗氧量，抑制血小板凝集，延 长凝血时间，降血脂，清除自由基，抗炎，抗氧化等药理作用，其中含量较高并有市售标准 品的有三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Re、Rb 1、Rb 2、Rd、 Rc 和 Rf 等 1，2 。目前，商品三七 的规格品种多样，质量不一。05 版药典规定三七为其原植物的根和根茎，其中主根为临床所 用三七，支根习称筋条，根茎习称剪口。三七总皂苷提取物生产厂家常用三七剪口或筋条为 原料，民间也有使用三七叶和花。而不同的三七药用部位及其提取物的主要皂苷类成分的含 量差别明显 3。因此，建立一种三七不同药用部位及其提取物中主要成分的 HPLC 指纹图谱 分析方法，比较不同药用部位和不同规格三七及其提取物的差异具有重要意义。本文采用 RP-HPLC/UV 法建立三七及其总皂苷提取物的 HPLC 指纹图谱分析方法，并对不同药用部位 和不同规格三七及其总皂苷提取物进行指纹图谱分析，比较其差异。 1. 仪器与试药 安捷伦 1200 型 HPLC，DAD 检测器；三七主根（20-100 头） 、筋条（支根） 、剪口（根 茎） 、叶、花均购自云南文山；三七对照药材（120941-200506） 、三七皂苷 R1(110745-200415)、 人参皂苷 Rg1(110703-200424)、Re(110754-200421)、Rb 1(110704-200420)、 Rb2（111715- 200802） 、Rb 3（111686-200501）和 Rf（111719-200502 ）对照品均购自中国药品生物制品检 定所；三七总皂苷提取物购自不同厂家或由本实验室制备；甲醇（AR） 、乙腈（Fisher 公司） ， 高纯水（Millipore 超纯水机） 。 2. 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18 色谱柱（2504.6mm，5m，100） ；流动相：乙腈（A）水 （B ）线性梯度洗脱（v/v） ，比例见表 1；流速：1mL min-1；柱温：30；检测波长： 203nm。进样量：20L。 表 1：乙腈（ A）水（B ）流动相梯度表（v/v） 时间 05min 520min 2045min 4550min 5060min 6070min 乙腈 （%） 520 2036 3680 80100 100 1005 水（%） 9580 8064 6420 200 0 095 2.2 对照品和供试品溶液的制备 分别精密称取适量三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Re、Rb 1、Rb 2、Rb 3 和 Rf 对照品，加甲 醇溶解，制成浓度约为 50gmL-1 的混合对照品溶液。 精密称取药材粗粉 2g，置于 250mL 锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称重，超声 （250w）提取 45min，冷却至室温，用甲醇补充损失的溶剂，提取液用微孔滤膜 （0.45m）滤过，即得供试品溶液（生药浓度 40mg/mL） 。 分别取上述对照品和供试品溶液，按照 2.1 色谱条件测定，进样 20L，记录 HPLC 色 谱图，其结果见图 1。精密吸取三七对照药材供试品溶液，按 2.1 色谱条件，参照文献 4的 质谱条件测定 HPLC/MS 总离子流（TIC） ，结果见图 2。 3 图 1. 三七对照药材的 HPLC/UV 指纹图谱 由图 1 可见，上述条件所得三七 HPLC 图谱具有出峰多，主要特征峰分离度好，样品制 备方法简单，结果重现等特点。 图 2. 三七对照药材的 HPLC/MS 总离子流图（负离子模式） 采用标准品对照和 HPLC/MS 提取离子流图对主要色谱峰进行鉴别，可共判定出峰 4 为 三七皂苷 R1、峰 5 为人参皂苷 Rg1 和 Re、峰 6 为人参皂苷 Rf、峰 7 为人参皂苷 Rb1、峰 8 为人参皂苷 Rc、峰 9 为人参皂苷 Rb2、峰 10 为人参皂苷 Rb3、峰 11 为人参皂苷 Rd。 2.3 参照峰和特征峰的选择 分别取三七主根（20、40、60、80 和 100 头规格） 、筋条（支根） 、剪口（根茎） 、叶和 花按 2.2 供试品溶液制备方法制备，按 2.1 色谱条件测定。根据色谱图，共确定三七中的主 要皂苷类成分和其他峰面积较大的（占总峰面积 1%以上） ，且分离良好的特征峰共 17 个， 选取三七特有的三七皂苷 R1 为参照峰（峰 4） ，以其保留时间和色谱峰面积为 1，计算其他特 征峰的相对保留时间和相对峰面积，进行方法学考察。 2.4 方法学考察 2.4.1 精密度实验 精密吸取三七供试品溶液，按 2.1 色谱条件测定，分别连续进样 5 次，以三七皂苷 R1 为 参照峰（S 峰） 分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，并计算 RSD。其中 S 峰 保留时间的 RSD 为 0.14%，峰面积的 RSD 为 0.46，其他特征峰的相对保留时间 RSD 在 0.013%0.21%，相对峰面积 RSD 在 0.29%3.44%。 2.4.2 稳定性实验 精密吸取三七供试品溶液，分别放置 1、2、3、5、7 天后，按 2.1 色谱条件测定指纹图 4 谱，以三七皂苷 R1 为参照峰（ S 峰）分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，并 计算 RSD。其中 S 峰保留时间的 RSD 为 0.14%，峰面积的 RSD 为 0.78，其他特征峰的相 对保留时间 RSD 在 0.038%0.20%，相对峰面积 RSD 在 0.47%4.24%。 2.4.3 重现性实验 精密称取同一批三七筋条（支根）9 份，按照 2.2 供试品溶液制备方法制备供试品溶液， 分别按 2.1 色谱条件测定，以三七皂苷 R1 为参照峰（S 峰） 分析所得图谱中特征峰的相对保 留时间和峰面积比，并计算 RSD。其中 S 峰保留时间的 RSD 为 0.28%，峰面积的 RSD 为 2.24，其他特征峰的相对保留时间 RSD 在 0.023%1.29% ，相对峰面积 RSD 在 3.48% 6.47%。方法学考察表明本方法精密度、稳定性和重现性良好，可满足三七 HPLC 指 纹图谱测定要求。 2.5 三七不同药用部位和不同规格三七主根的 HPLC 指纹图谱 分别精密称取 20、40、60、80、100 头三七主根、筋条（支根） 、剪口（根茎） 、叶和花 的粗粉 2g，按 2.2 供试品溶液制备方法制备，按 2.1 色谱条件测定，结果见图 3 和 4。以三 七皂苷 R1 为参照峰（S 峰）分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，结果见表 2 和表 3。 图 3. 不同规格三七主根的 HPLC 指纹图谱（S1-S5 分别为 20、40、60、80、100 头三七） 5 图 4. 三七不同药用部位的 HPLC 指纹图谱（S1-S5 分别是三七筋条、剪口、20 头、叶、花） 表 2. 不同规格和不同药用部位的三七的 HPLC 指纹图谱中主要峰的相对保留时间 峰号 化学成分 20 头 40 头 60 头 80 头 100 头 剪口 筋条 花 叶 1 未知 0.257 0.257 0.257 0.257 0.257 0.257 0.257 0.258 0.257 2 未知 0.404 0.405 0.405 0.405 0.405 0.405 0.406 0.407 - 3 未知 - - - - - - - 0.658 0.659 4 三七皂苷 R1 14.364 14.356 14.351 14.352 14.342 14.347 14.340 14.338 14.339 5 人参皂苷 Re 和 Rg1 1.080 1.079 1.080 1.079 1.079 1.079 1.080 1.078 1.078 6 人参皂苷 Rf - - - - - 1.565 - 1.573 - 7 人参皂苷 Rb1 1.603 1.602 1.603 1.600 1.602 1.604 1.600 1.600 1.594 8 人参皂苷 Rc 1.653 1.654 1.655 1.654 1.655 1.654 1.655 1.649 1.652 9 人参皂苷 Rb2 1.719 1.719 1.720 1.720 1.720 1.720 1.721 1.723 1.721 10 人参皂苷 Rb3 1.751 1.752 1.752 1.751 1.752 1.752 1.752 - - 11 人参皂苷 Rd 1.821 1.821 1.823 1.821 1.822 1.823 1.822 1.820 1.820 12 未知 1.889 1.890 1.890 - - 1.891 1.891 - - 13 未知 3.213 3.214 3.216 3.215 3.216 3.215 3.217 3.210 - 14 未知 3.567 3.597 3.598 3.597 3.599 3.598 3.600 3.580 3.633 15 未知 3.769 3.772 3.773 3.772 3.775 3.774 3.776 3.776 3.775 16 未知 - - - - - 3.920 - 3.922 - 17 未知 4.427 4.431 4.432 4.430 4.433 4.433 4.436 4.437 4.434 表 3. 不同规格和不同药用部位的三七的 HPLC 指纹图谱中主要峰的相对峰面积比 峰号 化学成分 20 头 40 头 60 头 80 头 100 头 剪口 筋条 花 叶 1 未知 0.311 0.331 0.300 0.192 0.690 0.146 0.161 7.620 2.468 2 未知 0.163 0.143 0.144 0.094 0.167 0.104 0.103 5.988 - 3 未知 - - - - - - - 17.757 4.206 4 三七皂苷 R1 峰面积 2278.7 2367.8 2247.4 3584.5 1960.3 4830.8 2735.2 207.6 289.6 5 人参皂苷 Re 6.136 5.942 6.263 3.249 5.777 3.367 4.088 2.558 2.646 6 和 Rg1 6 人参皂苷 Rf - - - - - 0.106 - 7.551 - 7 人参皂苷 Rb1 4.497 3.297 4.741 1.547 4.336 2.195 2.179 6.072 4.135 8 人参皂苷 Rc 0.420 0.473 0.697 0.286 0.505 0.327 0.449 9.516 5.103 9 人参皂苷 Rb2 0.231 0.299 0.339 0.127 0.266 0.309 0.211 14.500 5.874 10 人参皂苷 Rb3 0.240 0.284 0.429 0.107 0.292 0.149 0.333 - - 11 人参皂苷 Rd 1.479 1.062 1.749 0.516 1.059 0.765 0.788 2.890 2.757 12 未知 0.253 0.260 0.264 - - 0.117 0.158 - - 13 未知 0.355 0.485 0.491 0.354 0.423 0.565 0.933 7.204 - 14 未知 0.506 0.619 0.625 0.726 0.626 0.698 0.944 52.113 2.81 15 未知 1.345 0.778 0.753 0.450 0.774 0.509 0.644 25.381 14.782 16 未知 - - - - - 0.162 - 4.636 - 17 未知 0.519 0.526 0.522 0.321 0.562 0.238 0.409 6.471 4.947 从表 2 和 3 可知，1、4、5、7、8、9、11、14、15 和 17 号峰为所有三七样品的共有峰； 1、2、4、5、7、8、9、10、11、13、14、15 和 17 为地下部分的共有峰；3 号峰为叶和花的 特征峰。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版，国家药典委员会）分析，不同 规格三七（20-100 头）和三七地下部分（主根、剪口和筋条）的指纹图谱近似，相似度大于 0.971，但与三七花和叶差异很大，相似度分别为 0.596 和 0.564。 2.6 三七总皂苷的 HPLC 指纹图谱 采用乙醇回流提取，大孔吸附树脂纯化工艺制备三七总皂苷（主根、筋条和剪口） 。分 别精密称取不同来源的三七总皂苷，加甲醇超声溶解，配制成 2mg/mL 的溶液。按照 2.1 色 谱条件测定，分别进样 20L，记录色谱图。其结果见图 4。 7 图 4. 三七总皂苷 HPLC 指纹图谱（S1-S7 分别是三七根、筋条和剪口自提、宁波中药厂、昆 明圣火、云南红云、西安国圣） 不同来源的三七总皂苷提取物因药用部位（主根、剪口和筋条）及生产厂家（宁波中药 厂、昆明圣火、云南红云和西安国圣）不同，其主要特征峰（皂苷类）的峰面积及比例存在 较大差异，其中自产提取物（主根、筋条和剪口）和昆明圣火总皂苷相似度较高，相似度分 别为 0.958、0.954、0.870 和 0.872；其他厂家差别较大，相似度分别为 0.653、0.605、0.628；但所有提取物均有 4、5、7、8、9 和 11 号皂苷类成分特征峰。 3. 讨论 良好的 HPLC 分析方法是指纹图谱研究的前提，实验中我们采用网格搜索的方法系统研 究了流动相组成和梯度洗脱条件，发现乙腈的基线优于甲醇，水优于酸水（磷酸、甲酸和乙 酸） ，以表 1 的乙腈-水梯度洗脱系统可有效分离三七主要皂苷类成分。根据 DAD 光谱图比 较了文献 5-7中的 200、203、210nm 3 个波长下的色谱图 , 发现 203nm 处的峰信号强度大且 出峰多，主要特征峰干扰小、分离度和精密度好。实验中分别采用甲醇超声或回流提取，不 同浓度乙醇（60、70、80、95）超声或回流提取，甲醇或乙醇提取液 C18 固相萃取等方法 制备供试液。其中甲醇超声方法所得供试液图谱出峰多，重现性好，主要峰特征性强，多数 峰分离度好，样品制备方法简单、准确。上述三七 HPLC 指纹图谱测定方法经过方法学考察， 各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的精密度和稳定性 RSD 均小于 4.24%（n=5） ；9 次实 验的相对峰面积测试重现性 RSD 小于 6.47%，表明本方法精密度、稳定性和重现性良好，完 全能满足三七 HPLC 指纹图谱测定要求。 在本实验条件下，质谱的负离子检测模式对三七供试品有较好的信号响应，我们根据化 合物的质荷比，采用提取离子流图(EIC)对图中的各主要皂苷类色谱峰进行了分子量归属，结 果见图 5。在同一 EIC 图中各色谱峰的 m/z 值相同，由下至上各 EIC 图所对应的 m/z 依次为 1107.585、799.847、945.550 和 1077.584。其中 799.847 分别为人参皂苷 Rg1 和 Rf（t R 分别为 15.5 和 22.4min） ，9