多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂对脑缺血大鼠海马炎性因子表达水平的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂 对脑缺血大鼠海马炎性因子表达水 平的影响 【摘要】 中国论文网 /6/view-12956494.htm 目的探讨多聚腺苷二磷酸核糖聚 合酶(PARP)抑制剂 3-氨基苯甲酰胺（3- AB）对脑缺血大鼠海马炎性因子表达 水平的影响。方法 56 只大鼠随机分为 假手术组、脑缺血对照组、3-AB 组， 用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型， 用免疫组化学染色法观察大鼠海马 CA1 区肿瘤坏死因子-a（TNF-a）和基质金 属蛋白酶（MMP-9 ）的表达。结果与假 手术组比较，缺血对照组及 3-AB 组的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 海马 CA1 区 TNF-a 和 MMP-9 的表达均 明显增高(均 P 0.01)；与脑缺血对照 组比较，3-AB 组海马 CA1 区 TNF-a 和 MMP-9 的表达均明显减少（P 0.05） 。 结论 PARP 抑制剂 3-AB 能明显降低脑 缺血大鼠海马 CA1 区炎性因子 TNF-a 和 MMP-9 的表达水平，提示其有减轻 炎症反应及神经保护作用。 【关键词】脑缺血；多聚腺苷二 磷酸核糖聚合酶；3-氨基苯甲酰胺；肿 瘤坏死因子-a；基质金属蛋白酶 -9 The Protective Effect of PARP inhibitor on Cerebral Ischemia of Rats in Delayed Treatment Zhang wei-fa, Wang dong-yu 【Abstract】Objective To explore the poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) inhibitor 3-aminobenzamide(3-AB) on cerebral ischemia of rats in delayed treatment.MethodsThe rats were divided randomly into sham operation -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 group,ischemica control group, 3-AB group.Rat model of cerebral ischemia was established by left middle cerebral artery occlusion(MCAO).At the different time points, killed the rats and brain tissues of rats were isolated. The expressions of TNF-a and MMP-9 in hippocampus CA1 region after MCAO were detected in immuno-histochemical methed.ResultsCompared with ischemia groups, the number of TNF-a and MMP-9 positive cell in 3-AB group were decreased significantly at the same time point（P0.05 or P0.01）. Conclusion Administration of PARP inhibitor 3-AB at 8 h after MCAO has a large brains protective effect.This effect may be mediated by decreased the expression of TNF-a and MMP-9 in hippocampus CA1 region of rats,suppression of the post - ischemic brain inflammatory response. -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 【Key words】 brain ischemia;poly(ADP-ribose) polymerase; inflammation;tnf-a;mmp-9 【中图分类号】R743.3 【文献标 识码】B 【文章编号】1005-0515(2011) 10-0016-03 缺血性脑血管病具有高发病率、 高致残率及高死亡率等特点，近年来炎 症反应在缺血性脑损伤中的作用受到广 泛重视，脑组织的炎症反应主要特征是 小胶质细胞的的激活，研究发现小胶质 细胞的激活与多聚腺苷二磷酸核糖聚合 酶(PARP)密切相关 , PARP 是核转录因 子-kB (NF-kB)介导的小胶质细胞的基因 转录、整合素的表达、形态改变、迁移 和神经毒性所必需的因子，脑缺血后小 胶质细胞的全部激活需要较长的时间， 白细胞从外周血中浸润到脑组织需要更 长的时间1 。因此抑制 PARP 的活性 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 在延长缺血性脑卒中治疗时间窗、减轻 脑组织损伤等方面具有良好的应用前景， 目前国内尚无与此有关的报道。本实验 通过在大鼠大脑中动脉阻塞 8 h 后开始 给予 PARP 抑制剂 3-氨基苯甲酰胺 (3- AB)进行干预，观察大鼠缺血侧海马 CA1 区炎性因子肿瘤坏死因子-a（TNF- a）和基质金属蛋白酶（ MMP-9）表达 水平的变化，以探讨 PARP 抑制剂对脑 缺血大鼠脑组织炎性因子水平的影响， 为将来的临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂及仪器： 3- AB（sigma 公司） ；TNF-a 一抗（武汉 博士德生物技术有限公司） ；MMP-9 一 抗（北京中杉金桥生物技术有限公司） ； 显微镜 CH20BIMF200（奥林帕斯） ；细 胞图像分析系统 CIAS-1000（北京大恒 图像视觉有限公司） ；石蜡切片机 LEICA-RM2135（德国莱卡） ；电热恒 温培养箱 JC303-4（上海嘉和仪器设备 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 厂） 。 1.1.2 实验动物及分组： 健康雄 性 SD 大鼠 56 只，质量 200240 g，由 山东大学医学院动物实验中心提供，随 机分为假手术组(8 只) 、脑缺血对照组 (24 只)和 3-AB 组(24 只)，后两组根据 脑缺血时间各分为 24 h、 48 h、72h 3 个 亚组，每个亚组 8 只。 1.2 方法 1.2.1 模型制作与处理： 参照改 良的 Longa 法2制备大鼠左侧大脑 中动脉局部脑缺血模型。大鼠经 10%水 合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，颈部 正中切口，在左侧肩胛舌骨肌与胸锁乳 突肌三角处暴露左颈总动脉（CAA） 、 颈外动脉（ECA） 、颈内动脉（ICA） ， 结扎颈总动脉近心端、颈外动脉起始端， 将一端烧成圆头（圆头直径约 0.260.30 mm）的鱼线经 CCA 分叉处通过 ICA 入颅，插至大脑中动脉起始部，插入深 度约为(18.00.5)mm。假手术组除不插 入鱼线外，其余操作相同。术中用电热 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 毯和电烤灯保持大鼠肛温在 3637 。 按 Longa(04)5 分制评分标准2在手 术结束大鼠麻醉清醒后进行神经功能缺 失评分。评分为 13 分的大鼠为合格脑 缺血模型，对不合格大鼠所在组进行补 充。 3-AB 组大鼠左侧在制模成功后 8 h 经腹腔注射 3-AB（10 mg/kg） ，每隔 12 h 重复给药一次,直至大鼠处死，另两 组给予等剂量生理盐水。 1.2.2 海马 CA1 区 TNF-a 和 MMP-9 表达检测： 在规定时间点将大鼠以 10%水合 氯醛（3 ml/kg）麻醉后，快速打开胸腔， 经左心室灌流内固定后，断头取脑，在 视交叉后 1 mm 及 5 mm 处冠状切面切 开,取中间脑组织放入相同固定液中继续 外固定,4过夜，常规梯度乙醇脱水、 二甲苯透明、浸蜡、包埋，在海马齿状 回连续冠状切片（厚 7 m） ，每隔 5 片 取 1 片，行免疫组化染色。TNF-a 的表 达检测采用 SABC 免疫组化染色法， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 MMP-9 表达检测采用 S-P 免疫组化染 色法，免疫组化染色操作严格按试剂盒 说明书进行，阴性对照以 PBS 分别代替 TNF-a、MMP-9 抗体。TNF-a、MMP-9 阳性细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色。应用 CIAS-1000 多媒体细胞图像分析系统分 析免疫组化切片，每张切片选取 5 个不 重复视野，400 倍显微镜下计数 TNF- a、MMP-9 阳性细胞数。 1.2.3 统计学处理：采用 SPSS13.0 统计软件进行统计分析，检测 数据以均数标准差(Xs)表示，组间比 较采用 LSD 检验。 2 结果 2.1 各组大鼠海马 CA1 区 TNF- 表达水平的比较，见表 1。脑缺血对照 组及 3-AB 组 TNF- 阳性细胞表达较假 手术组明显增高（均 P 0.01） ；3-AB 组各亚组 TNF- 阳性表达较相应时间点 的脑缺血对照组各亚组明显减少（均 P0.05） 。 表 1 各组大鼠缺血侧海马 CA1 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 区 TNF-、 MMP-9 表达的阳性细胞数比较 (xs) 注：与假手术组比较*P0.01； 与缺血组比较 P0.05， P0.01 2.2 各组大鼠海马 CA1 区 MMP- 9 表达水平的比较，见表 1。脑缺血对 照组及 3-AB 组 MMP-9 阳性细胞表达 较假手术组明显增高（均 P0.01） ；3- AB 组各亚组 MMP-9 阳性表达较相应 时间点的脑缺血对照组各亚组明显减少 （均 P0.05 ） 。 3 讨论 PARP 是一类广泛存在于大部分 真核细胞生物中的蛋白质翻译后修饰酶， 其包括众多的家族成员，目前已确认了 18 种具有潜在 PARP 活性的结构亚型 A,研究发现只有 PARP-1 、PARP- 2 能被 DNA 链断裂所激活。当 DNA 链 发生断裂时，PARP 作为 DNA 损伤的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 敏感子与信号转导子，快速的识别并结 合到 DNA 断裂处，以 NAD+为底物， 催化 NAD+上的 ADP-核糖单元到组蛋 白、拓扑异构酶、p53 及 PARP 本身等 多种核蛋白上，使这些受体核蛋白发生 聚 ADP 核糖基化反应(PAR 化)3,4 。 PARP 依据 DNA 的损伤程度及其底物 NAD+的水平发挥双重作用，生理状态 下或少量的 DNA 损伤时，活化的 PARP 通过使受体蛋白发生 PAR 化,具 有参与 DNA 链的修复等功能。但当 DNA 在诸如缺血、氧自由基、电离辐 射等强烈刺激下大量损伤时，过度活化 PARP 可通过耗竭大量的底物烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸(NAD+) 和 ATP、从线粒 体内转运凋亡诱导因子(AIF)到细胞核内、 过量的表达炎症介质、减少促存活因子 表达等机制加剧细胞损伤5 。Szabo 等6提出 PARP 的过度激活是细胞 死亡的共同的终末通路。 脑缺血后脑组织的炎症反应主 要特征是小胶质细胞的的激活，激活的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 小胶质细胞可释放谷氨酸、细胞活素类、 活性氧簇、蛋白酶等促炎症介质，促进 缺血后神经元死亡1 。小胶质细胞的 活化和增值依赖于 PARP-1 和 NF-kB 的 相互作用, PARP 是 NF-kB 转运和炎症 反应所必需的共同激活剂，PARP 促成 多种转录因子包 NF-KB、AP-2 的聚 ADP 核糖基化过程，NF-kB、AP-2 转 录因子在炎症细胞裂解坏死、分子黏连 以及炎症介质的表达过程中发挥核心作 用1.7 ，这预示着 PARP 在炎症过程 中发挥重要作用。 TNF-a 和 MMP-9 是脑缺血后继 发性损伤两种重要的炎症介质。TNF-a 是一种多向能细胞因子，具有多种生物 学功能，在炎症和免疫反应时尤为重要， 脑缺血后其可作为触发因素激活细胞因 子网络，扩大脑组织损伤作用8 。基 质金属蛋白酶(MMPs) 是一组钙锌依赖 性肽链内切酶家族，具有降解细胞外基 质成份的作用，MMPs 特别是 MMP-9 与脑缺血后微血管血脑屏障损害和神经 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 系统炎症反应有关9 。 本研究发现，在大鼠大脑中动脉 阻塞 8 h 后开始给予 PARP 抑制剂 3-AB 进行干预，能明显的减少缺血侧海马 CA1 区 TNF-、MMP-9 阳性细胞的表 达，与脑缺血组比较，差异有显著统计 学意义。这表明在脑缺血发生后给予 PARP 抑制剂，可明显降低炎性因子表 达水平，减轻炎症反应，因此具有神经 保护作用。对于 PARP 抑制剂减少缺血 后脑组织 TNF-a 和 MMP-9 表达的机制 目前尚未被完全阐明，推测可能与 PARP 抑制剂减弱 TNF-a 和 MMP