1-046 大肠杆菌检查法标准操作程序

1 目的：规范大肠杆菌检查操作，保证检验结果准确。 2 范围：本程序适用于药品大肠杆菌的检查。 3 责任者：QC 员、QC 复核人员、QC 主任。 4 程序： 4.1 试药与试液 除特别注明外，试验中所用的试剂均为分析纯试剂，水为纯化水。 4.1.1 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠NaCl9.0g，加水使溶解成 1000ml，121灭菌 20 分钟。 4.1.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2) 取磷酸氢二钠Na2HPO412H2O25.8g 和磷酸二氢钠NaH2PO4H2O4.4g，加 水使溶解至 1000ml，121灭菌 20 分钟。 4.1.3 萘酚乙醇试液 取 萘酚 6.0g，加无水乙醇溶解使成 100ml。 4.1.4 40氢氧化钾试液 取氢氧化钾 40g，加水溶解使成 100ml。 4.1.5 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛C9H11NO1g，加入 95%乙醇C2H5OH95ml，充分振摇，使 完全溶解后，取浓盐酸HCl20ml 徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液 色泽变深，置冰箱保存，备用。 4.1.6 甲基红试液 取甲基红C15H15N3O20.1g，加 95%乙醇C2H5OH300ml 与水适量，使溶解，再 加水至 500ml，即得。 4.1.7 V-P 试液 取 -萘酚C10H7OH6.0g，加无水乙醇C2H5OH使溶解成 100ml。另取氢氧化 钾 40.0g，加水使溶解成 100ml。分别将试药与各溶剂混合即得。 4.1.8 革兰染色液 4.1.8.1 沙黄染液 取沙黄 0.25g，加 95%的乙醇C2H5OH10ml，使完全溶解后，加水至 100ml。 4.1.8.2 结晶紫染液 取结晶紫C25H30ClN31.0g，加 95%的乙醇C2H5OH20ml，使溶解，加 1%的草 酸铵溶液 80ml，混匀。静置 48 小时使用，置密闭棕色瓶中储存。 4.1.8.3 碘试液 取碘化钾KI2.0g，加水 35ml 使溶解，加入碘片I21.0g，使全部溶解后， 加水稀释至 300ml，置密闭棕色瓶中储存。 4.1.8.4 95乙醇。 4.1.9 溴麝香草酚蓝指示液 4.2 培养基的种类 4.2.1 营养肉汤培养基 4.2.2 营养琼脂培养基 4.2.3 胆盐乳糖培养基（BL） 4.2.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG) 4.2.5 乳糖培养基 4.2.6 5%乳糖培养基 4.2.7 蛋白胨水培养基 4.2.8 磷酸盐葡萄糖胨水培养基 4.2.9 枸橼酸盐培养基 4.2.10 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 4.3 对照用菌液 取大肠杆菌CMCC (B) 44102的营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml 营 养肉汤培养基内，361培养 1824 小时后，用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 1:106，使对照菌液加入量含菌 50100 个（一般用量为 0.1m1） ，其菌数在做阳 性对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。 4.4 仪器与设备 4.4.1 菌检室。 4.4.2 净化工作台，恒温培养箱（361） ，微波炉，恒温水浴（451） ， 高压蒸汽灭菌器，电冰箱，匀浆仪，离心机（5004000 转/分钟） ，显微镜 （1500 标 准 操 作 程 序 STANDARD OPERATING PROCEDURE 部门： 题目： 大肠杆菌检查法标准操作程序 共 10 页 第 3 页 编号： S/SOP/QC1-046-0 起草： 部门审核： 质量部审核： 批准： 实施日期： 倍） ，紫外灯（366nm） 。 4.4.3 薄膜过滤装置：微孔滤膜直径约 50mm，孔径 0.450.02m。 8.4 锥形瓶（250300ml，内装玻璃珠若干） ，研钵（陶瓷制，直径 l012cm） 、 培养皿（9cm） ，量筒（100ml） ，试管（18180mm）及塞，吸管（1ml 分度 0.01，10ml 分度 0.1） ，注射器（20ml 或 30ml） ，注射针头，载玻片，盖玻片、 玻璃消毒缸（带盖） 。 4.4.4 玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距 0.5cm 处塞 入约 2cm 的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均 应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免 振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于 160干热灭菌 2 小时或高压蒸汽 121灭菌 30 分钟，烘干备用。 4.4.5 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用 7075%乙醇溶 液浸泡） 。 4.4.6 无菌衣、帽、口罩、手套。洗净后配套，用牛皮纸包严，灭菌，备用。 4.4.7 接种环（白铱金或镍铬合金，环径 45mm、长度 610cm） ，乙醇灯，乙 醇棉球或碘伏棉球，灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子，灭菌钢锥，灭菌称样 纸，不锈钢药匙，试管架，火柴，记号笔，白瓷盘，洗手盆，陶瓦盖（12cm） 等。 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照菌检室物品进 出标准操作程序 （SOP QC-003-00）进行操作。 4.5 准备 4.5.1 供试品的检验量 4.5.1.1 所有剂型的检验量均需取 2 个以上包装单位。 4.5.1.2 固体制剂检验量为 l0g。 4.5.1.3 液体制剂检验量为 l0ml。 4.5.1.4 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固 体制剂不低于 3g，液体制剂采用原液者不得少于 6ml，采用供试液者不得少于 3ml，外用药品不得少于 5g。 4.5.2 供试液的制备 标 准 操 作 程 序 STANDARD OPERATING PROCEDURE 部门： 题目： 大肠杆菌检查法标准操作程序 共 10 页 第 4 页 编号： S/SOP/QC1-046-0 起草： 部门审核： 质量部审核： 批准： 实施日期： 4.5.2.1 液体供试品。取供试品 l0ml，置灭菌锥形瓶中，加入 90ml 稀释剂， 摇匀，作为 1:10 供试液。 4.5.2.2 固体供试品。称取供试品 10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入 0.9%无菌氯化钠溶液 100ml，用匀浆仪，振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。 4.5.2.3 含抑菌成分供试品。供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌。不 能检出时，该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。 同时做阳性和阴性对照。 4.5.2.3.1 稀释法。取规定量的供试液种入较大体积的培养基中，使该供试液 稀释至不具抑菌作用的浓度。 4.5.2.3.2 离心沉淀集菌法。取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，3000 转/分钟离心 30 分钟，移去上清液，留底部集菌液约 2ml，并稀释该供试液至 原规定量。如有不溶性药渣，可先以 500 转/分钟离心 5 分钟，取全部上层液， 再按上述方法集菌处理。 4.5.2.3.3 薄膜过滤法。取规定量的供试液于稀释剂 100ml 中，摇匀，以无菌 操作加入装有直径约 50mm、孔径不大于 0.450.02m 微孔滤膜的薄膜过滤器 内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于 100ml，将培养基加入滤器或取出 滤膜，加入增菌培养基中。 4.5.2.3.4 沉降法。取规定量供试液，自然沉降 5 分钟，取上层液于 100ml 增 菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。 4.6 检验程序 4.7 增菌培养 取胆盐乳糖培养基（BL）3 瓶，每瓶各 100ml。2 瓶分别加入规定量的供试 液，其中 1 瓶加入对照菌 50100 个作阳性对照，第 3 瓶加入与供试液等量的稀 释剂作阴性对照。37培养 1824 小时（必要时可延至 48 小时） 。阴性对照应 无菌生长。 摇匀上述 BL 增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试 供 试 品 供 试 液 BL 增菌培养液 MUG 蛋白胨 MUG 阳性、靛基质阳 性 MUG 阴性、靛基质阴 性MUG 阳性、靛基质阴 性 MUG 阴性、靛基质阳 性 EMB 或 麦康凯琼脂平板 疑似菌落纯培养 革兰染色、乳糖、 靛基质、甲基红、 V-P、枸橼酸盐利 用 361 1824 小时 361 4、24 小时 报告 361 1824 小时 361 1824 小时 361 2448 小时 报告 标 准 操 作 程 序 STANDARD OPERATING PROCEDURE 部门： 题目： 大肠杆菌检查法标准操作程序 共 10 页 第 6 页 编号： S/SOP/QC1-046-0 起草： 部门审核： 质量部审核： 批准： 实施日期： 品阳性对照培养液、阴性对照培养液各 0.2ml，分别加入 4-甲基伞形酮葡糖苷 酸培养基（MUG）管，37培养 4、24 小时后，将各管置 366nm 紫外灯下观察有 无蓝白色荧光，然后靛基质试液 45 滴于上述 MUG 管内，观察液面颜色。MUG 阳性（有荧光） 、靛基质阳性（玫瑰红色） ，报告检出大肠杆菌；MUG 阴性（无 荧光） 、靛基质阴性（无色） ，报告未检出大肠杆菌。 4.8 分离培养 如 MUG 阳性、靛基质阴性或 MUG 阴性、靛基质阳性时，将上述供试品 BL。 增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取 12 环培养液划线于 EMB 平板上，培养 1824 小时，观察 EMB 平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈 典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于表 1 所列特 征，可判为供试品 1g 或 1ml 未检出大肠杆菌。 表 1 大肠杆菌菌落形态特征 培养基 菌 落 形 态 曙红亚甲蓝琼脂 （EMB） 典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿 润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心 紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。 麦康凯琼脂 典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。 当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因， 重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长 者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMVic 试验。 4.9 纯培养 如生长菌落与表 1 所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌 落的表面中心，沾取培养物，应挑选 23 个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂 斜面，培养 1824 小时，作以下检查。 如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽） ，应沾 取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于 EMB 琼脂平板，培养 标 准 操 作 程 序 STANDARD OPERATING PROCEDURE 部门： 题目： 大肠杆菌检查法标准操作程序 共 10 页 第 7 页 编号： S/SOP/QC1-046-0 起草： 部门审核： 质量部审核： 批准： 实施日期： 1824 小时，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。 4.10 革兰染色、镜检 4.10.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜 面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰 23 次（载 玻片不烫手）固定。 4.10.2 滴加结晶紫染液，染色 1 分钟，水洗。 4.10.3 滴加碘液，媒染 1 分钟，水洗，以滤纸吸干余水。 4.10.4 滴加 95%乙醇，脱色 2030 秒钟，水洗。 4.10.5 滴加沙黄染液，复染 1 分钟，待干后，镜检。 4.10.6 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌， 或球杆菌状，亦有杆菌状。 4.10.7 注意事项 4.10.7.1 玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连 成片。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。 4.10.7.2 培养物的菌龄以 1624 小时为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染 成红色。 4.10.7.3 脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染 成阴性。 4.11 生化试验 4.11.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养 2448 小时，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄 色） ，产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小） 。 为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种 5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓 发酵乳糖的细菌，可于 24 小时出现阳性。或适当延长培养时间。 4.11.2 靛基质试验（1） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养 2448 小时，沿管壁加 入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴 性。 标 准 操 作 程 序 STANDARD OPERATING PROCEDURE 部门： 题目： 大肠杆菌检查法标准操作程序 共 10 页 第 8 页 编号： S/SOP/QC1-046-0 起草： 部门审核： 质量部审核： 批准： 实施日期： 98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性。一般 24 小时即可出现阳性结果，以无菌操 作先从管中取出 1 或 2ml 培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水 培养物再培养 24 小时，作靛基质试验。 4.11.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养 482 小时， 于培养液中加入甲基红指示液 23 滴（约每 ml 培养液加指示液 1 滴） ，轻微摇 动，立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。 4.11.4 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养 482 小时， 于 2ml 培养液中加入 -萘酚乙醇试液 1ml，混匀，再加 40%氢氧化钾试液 0.4ml，充分振摇，在 4 小时（通常在 30 分钟）内出现红色应判为阳性，无红 色反应为阴性。 4.11.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养 24 天，培养基 斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌 苔生长为阴性。 4.12 结果判断 4.12.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验 MUG 呈阳性，供试晶 MUG 阳性、 靛基质阳性，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠杆菌。MUG 阴性、靛基质阴性，报 告 1g 或 1ml 供试品未检出大肠杆菌。 4.12.2 MUG 阳性、靛基质阴性、IMVic 试验为 + 、革兰阴性杆菌， 报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠杆菌；MUG 阴性、靛基质阳性、IMViC 试验为 + + 、革兰阴性杆菌，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠杆菌。 4.12.3 供试品培养物检查不符合 9.6.2 二项中的任一项，报告 1g 或 1ml 供试 品未检出大肠杆菌。 4.12.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不 能作出检验报告。 4.13 注意事项 4.13.1 MUG 法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志 贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其 MUG 为 阳性。因此，在 MUG 培养基成分中增加丁去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干 扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能 检出。既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。 4.13.2 配制 MUG 培养基时，务必校正 pH 值，灭菌后 pH 不得过 7.4，否则 pH 值偏高，MUG 分解，本身则显荧光；分装 MUG 培养基的试管应挑选，试管、蛋 白胨不得显荧光。 4.13.3 培养时间 供试品培养液接种于 MUG 培养基中的培养时间，一般在 4 小时、24 小时观 察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至 48 小时再观 察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的 GUD 的活性不完全相同，对底物和底物的 浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH 的改变；大 量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。 4.13.4 结果观察 取供试品的 MUG 试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在 366nm 紫外灯下 观察，阳性对照管应有较强蓝白色