仪器分析第十一章色谱法分离原理

第十一章 色谱法分离原理 学习目的 通过本章学习，应了解色谱法的分类，理 解色谱法分离过程及分离原理，掌握色谱 图及相关术语，掌握分离度概论及应用， 掌握色谱法定性及定量分析。 本章主要内容 11.1 色谱法概述 11.2 线性洗脱色谱及相关术语 11.3 色谱法基本理论 11.4 分离度 11.5 色谱法定性和定量分析 11.1 色谱法概述 一、历史回顾 二、色谱法 (Chromatography) 色谱法的实质是 分离 ，是一种重要的 分离 、分析技术 。它是根据混合物各组分在互 不相溶的两相 固定相与流动相中吸附能 力、分配系数或其它亲合作用性能的差异 作为分离的依据。 当混合物各组分随着流动相通过固定相时 ，在流动相与固定相之间进行反复多次的 分配，这样就使得那些吸附能力或分配系 数只有微小差别的物质，在移动速度上产 生了较大的差别，从而得到分离。 三、色谱法的分类 色谱法有许多类型，从不同的角度可以有 不同的分类方法，主要包括以下几类： 1.按流动相和 固定相的物态 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱 气 -固，气 -液色谱 液 -固，液 -液色谱 2.按固定相的 固定方式 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 3.按分离过程的机理 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 4.按色谱动力学过程 迎头色谱：以试样混合物作 流动相的色谱法 顶替色谱：用含吸附能力或其它作 用能力比被分析物强的组分作流动相 洗脱色谱：用含吸附能力或其它 作用能力比被分析物弱的气体或液体 作流动相。又分线性和非线性两种 11.2 线性洗脱色谱及相关术语 一、色谱分离过程 现以在填充柱内进行的分配色谱来说明色 谱的分离过程。 固定相：涂在惰性载体上的液体 流动相：气体，其连续不断地流经固定相 两相充分接触，但互不相溶。 1.将混合物一次注入色谱柱后，流动相不断 地流入色谱柱。由于试样分子与两相分子 间的相互作用，它们既可以进入固定相， 也可以返回流动相，这个过程叫分配。 当样品进入流动相时，它就随流动相一起 沿柱子向前移动；当它进入固定相时，就 被滞留而不再向前移动。 与固定相分子作用力越大的组分，越易进 入固定相，向前移动的速度越慢；与流动 相分子作用力越大的组分，越易进入流动 相，向前移动的速度越快。 这样经过一定的柱长后，由于反复多次的分配， 即使原来性质（如沸点、溶解度、分子结构及极 性等）差异微小的组分，也能达到很好的分离。 如图所示 色谱分离过程示意图 2.色谱分离过程的特点 不同组分在通过色谱柱时移动速度不同 各组分分子沿柱子的扩散分布 3.分配系数（参见教材 478-479页） 上述色谱分离过程涉及到组分在两相之间 的分配平衡，可以用分配系数 K来定量讨论 分配系数： K=cs/cm 是指在一定 T、 P下组 分在两相间达到平衡时，在两相中的浓度 比，为热力学参数。 典型的分配等温线 K=cs/cm 当 K与浓度无关 时，分配等温 线是线性的。 K为常数时所进 行的色谱过程 为线性色谱。 分布等温线方程参见 教材 479-481页 二、色谱图及相关术语 1.色谱图 色谱流出曲线 2.相关术语 (1)基线：色谱柱中仅有流动相通过时，检 测器响应信号的记录值。稳定的基线应是 一条水平直线。 (2)峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距 离，以 h表示。 (3)保留值 死时间 tM：不被固定相吸附或溶解的物质 进入色谱柱时，从进样到色谱图上出现峰 极大值所需的时间。 对于气相色谱， tM是指从进样到空气峰（对 热导检测器）最高点所经过的时间。 tM=L/ 保留时间 tR：试样从进样开始到柱后出现 峰极大值时所经历的时间。 调整保留时间 tR：组分的保留时间与死 时间之差。 tR= tR- tM（单位可用时间或距离） 注：保留时间是色谱法定性分析的基本依 据，但同一组分的保留时间常受到流动相 流速的影响，在 GC中尤为显著，因此，常 用保留体积等参数进行定性鉴定。 保留体积 VR：从进样开始到色谱峰最大 值出现时所通过的流动相的体积，单位 mL 。 VR=FctR 注：对于液体，可以认为不可压缩，所以 在 LC中， Fc即为实测值；对于 GC，由于气 体可压缩，因此必须根据色谱柱的工作状 态，对实验值进行校正，才能得到 Fc。 死体积 VM：不被保留的组分通过色谱柱 所消耗的流动相的体积。 VM=FctM VM本意是指色谱柱中，未被固定相占据的 空隙体积，即色谱柱内流动相的体积 (Vm)。 因此有： VMVm 调整保留体积 VR：保留体积减去死体积 。 VR=VR-VM=tRFc 相对保留值（ 2,1）：某组分 2的调整保留 值与组分 1的调整保留值之比。 2,1 = tR2/ tR1 其值只与柱温及固定相的性质有关，与柱 径、柱长、填充情况及流动相流速无关， 因此， 2,1 是色谱法中，尤其是 GC中广泛 使用的定性参数。 在定性分析中，通常固定一色谱峰作为标 准（ s），然后再求其它峰（ i）对标准物峰 的相对保留值（ s,i）。 一般情况下，选择一对最难分离的物质， 将它们的相对保留值作为重要参数，此时 用 来表示 相对保留值。 = tR2/ tR1（ tR2 tR1 ） 称为选择因子（ 1） 注： 值越大，越容易分离，若 =1，情况 如何？ 保留因子 k （又称分配比、容量因子） 组分在固定相和流动相中的分配量之比 k = ns / nm 保留值与分配系数 K之间的关系 当某一组分的色谱峰最高点出现时，说明 该组分恰好有一半的量洗脱在保留体积的 流动相中，刚好流出色谱柱，其余一半则 仍留在柱内。 根据物料等衡原理得： VRcm=Vmcm+Vscs VR=Vm+(cs/cm)Vs VR=Vm+KVs 又 VMVm VR=VM+KVs VR=KVs 以上说明了色谱行为的保留值（ VR、 VM、 VR）与反映物质的热力学常数 K之间的关 系。 保留值与容量因子 k之间的关系 由 K=cs/cm 得 又将上式改写 注： k是色谱柱对组分保留能力的参数， k，则保留时间越长 又因为相对保留值（选择性因子） (4)区域宽度：即色谱峰的宽度，有三种表 示法。 峰底宽度 Y(W)（基线宽度） 在色谱峰两边的转折点所画的切线与基线 相交的截距。 转折点也称拐点，是指流出曲线上二阶导 数为零的那两个点，经计算：拐点位于 0.607h处。 半峰宽 Y1/2(2 X1/2)： 即峰高一半处对应 的峰宽。 标准偏差 ：拐点间距离的一半。 注： Y=4 Y1/2=2.354 当标准偏 差以时间为单位时，用 表示， Yt=4 (5)峰面积 A：峰与基线延长线所包围的面积 称为峰的面积。 A=1.065hY1/2 总结： 从色谱流出曲线上，可以得到的重要信息 ： （ 1）混合组分中含有最小个数； （ 2）可进行定性分析； （ 3）可用于定量分析； （ 4）保留值及区域宽度是评价色谱柱分离效 能的依据； （ 5）两峰的间距是评价固定相选择是否合理 。 11.3 色谱法基本理论 色谱法是一种分离分析技术，无论定性还 是定量分析，前提条件都必须使两组分分 开。要使两组分 A、 B完全分开，必须满足 下列几点： 两组分的分配系数不等，即 KAKB 峰扩宽的速率应小于峰分离的速率 在保证快速分离的前提下，有一定长度 的色谱柱。 一、塔板理论 塔板理论是将一根色谱柱视为一个精馏塔 。即把一根连续的色谱柱设想成由许多小 段（称塔板）组成，每块塔板高度用 H表示 。 在每一小段内，组分在两相间很快达到分 配平衡，然后随流动相按一个一个塔板的 方式向前移动，并不断达到新的分配平衡 。 若色谱柱的长度为 L，则理论塔板数 n为： n=L/H 当 n50时，即可得到基本对称的峰形曲 线。 对于色谱柱， n值都很大， GC中， n值约 为 103106，则流出曲线可趋近于正态分布 。当 A、 B两试样的 K值有微小差异时，也 能得到很好的分离。 由塔板理论，可导出理论塔板数 n的计算 公式： 在实际工作中，上式计算的结果不能充分反映色谱柱的柱效， 因为 tR没有扣除 tM，扣除后计算的结果为有效塔板数，因此 塔板理论的特点和不足 (1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板 高度 H 越小 )，被测组分在柱内被分配的次 数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄 。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同 ，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量 柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果 ，当两组分的分配系数 K相同时，无论该色 谱柱的塔板数多大，都无法分离。 (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载 气流速下柱效不同的实验结果，也无法指 出影响柱效的因素及提高柱效的途径。 二、速率理论 1956年，荷兰学者 Van Deemter等人在研 究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理 论 速率理论。它吸收了塔板理论的有益 成果 塔板高度的概论，并把影响塔板高 度的动力学因素结合进去，提出理论塔板 高度 H是色谱峰展宽的量度，导出了塔板高 度 H与载气线速度 的关系： H = A + B/+ C （式中 ABC均 为 常数） A 涡流扩散项 B 分子扩散项系数 C 传质阻力项系数 流动相的平均线流速即单位时间内流 动相在色谱柱中流动的距离 cm/s 由上式，要降低 H的数值，提高柱效，需降 低式中各项系数值。 1.涡流扩散项 A 在填充色谱柱中，流动相（载有组分分子 ）通过填充物的不规则空隙及填充物颗粒 时，不断改变流动方向，形成紊乱的类似 “ 涡流 ”的流动。由于填充物颗粒大小的不同 ，以及填充的不均匀性，使组分分子通过 填充柱时，有许多长短不等的路径。因此 ，同一组分的不同分子，到达柱尾出口处 的时间有先有后，形成了一个统计分布， 色谱峰变宽。如图所示 A=2dp 填充不规则因子（包括固定相颗粒大小 、几何形状及装填紧密程度）。 dp 填充物颗粒的平均直径。 注： A与流动相的性质、线速度和组分性质 无关。 2.分子扩散项 B/（又称 纵 向 扩 散 项 ） 当 试样 被 载 气 带 入色 谱 柱后，以 “塞子 ”的 形式存在于色 谱 柱的很小一段空 间 ，便在 色 谱 柱的 轴 向上造成 浓 度梯度，使 组 分分 子 产 生 浓 差 扩 散。 B=2Dg 填充柱内气体扩散路径弯曲的因素，也 称弯曲因子。 Dg 组分分子在气相中的扩散系数 cm2s-1 与柱子的装填质量有关，若无填充物 =1 ，当有填充物时 1，但对不同的材料 值 不同。 Dg除与组分性质有关外，还与组分在气相 中的停留时间、载气的性质、柱温等有关 。即柱压 P,Dg;T,Dg;Dg 1/M 由上分析，若要减小分子扩散项，可采取 那些措施？ 3.传质阻力项 C 物 质 系 统 由于 浓 度不均而 发 生的物 质 迁移 过 程称 为传质 。影响 该过 程 进 行速度的阻 力，叫 传质 阻力。包括流 动 相和固定相。 对 于气液色 谱 气相中的传质过程是在气相和气液界面 上进行的，由于传质阻力的影响，使试样 在两相界面不能达到瞬时的分配平衡，出 现超前或滞后现象，使色谱峰展宽。 因此，气相的传质阻力项为： Cg Cg与 dp2成正比，与 Dg成反比，因此，采 用粒度小的填充物和相 对 分子量小的气体 （ H2）作 载 气，可提高柱效。 固定相中的传质发生在气液界面，这一 过程也会引起峰展宽，其传质阻力相为： Cl df 固定液的液膜厚度 Dl 组分在液相中的扩散系数 因此，传质阻力项系数 若通过降低 df来减小 C，则 k值随之变小， C 会增大。因此，在不减少固定液用量的同 时，用比表面积较大的载体来达到降低 df的 目的。 提高柱温， Dl会增大，但会使 k减小，故应 控制适当的柱温。 当固定液含量较高、 大小适中时， H主要 受 Cl控制，此时 Cg可忽略。 当固定液含量较低， 很快时，则 Cg的影 响会大增。 4.Van Deemter方程（速率理论方程） 范氏方程指出了色谱柱填充的均匀程度、填料粒度的大小、 流动相的种类及流速、固定相的液膜厚度等对柱效的影响。 除此之外，还应考虑柱径、柱长对峰展宽的影响。 范氏方程并非完美，其他学者对它进行了修正 GC中，以 H 作 图 得到双曲 线为 范氏方程曲 线 。 速率理论的要点 (1)组分分子在柱内运行的 多路径与涡流扩 散 、浓度梯度所造成的 分子扩散 及 传质阻 力 使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到 等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要 原因。 (2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类 、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 (3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提 供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效 及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约，如载气流速增大， 分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但 同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下 降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了 分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使 柱效达到最高。 11.4 分离度 一、柱效和选择性 在色谱分析中，常遇到难分离物质对的分 离问题。要将二组分进行分离，一是两峰 之间的距离要大，即二者的调整保留时间 差要大，可用 表示；二是色谱峰要窄，即 柱效要高，可用 H来量度。 选择性反映了色谱柱对物质保留值的差别 ，是色谱过程的热力学性质。 柱效反映了峰扩展的程度，是色谱过程动 力学性质。 但二者都不能表示色谱柱的总分离效能， 考虑二者的综合影响，需引入分离度的概 念。 二、分离度 (Rs)的定义 分离度也称分辨率，是指相邻两色谱峰保 留值之差与两峰底宽平均值之比。 两峰间的分离 程度受两峰尖 的距离和两峰 各自峰宽的制 约，如图所示 一般来说： 当 Rs1时，两峰部分重叠；（没有完全分 开） 当 Rs=1时，两峰能明显分离；（约 2的相 互重叠） 当 Rs=1.5时，两峰已完全分离（约 1%的 相互重叠） 请问是否 Rs越大越好？ 三、分离度公式 分离度概括了色谱过程动力学和热力学特 性，是衡量色谱柱分离效能的总指标，分 离度的定义式是经验式，没有体现影响分 离度的各种因素，即柱效 (n)、选择因子 () 和容量因子 (k)。 设有两个相近的色谱峰 A和 B，假定 YA=YB ，则谱带 A和 B的理论塔板数相同，以 n表 示。 由： 得： 又： 则： 在色谱分离过程中，总希望在尽可能短的时间 内获得尽可能高的分离度，但在相同的色谱条 件下是不可能同时达到的。 一般是预定分离度，然后用下式估算所需要的 理论塔板数及分析时间。 11.5 色谱法定性和定量分析 一、定性分析 色谱图中每一个峰代表一个物质，在色谱 条件一定时，任何一种物质都有确定的保 留时间。 因此，在相同色谱条件下，通过 比较已知物和未知物的保留值或在固定相 上的位置，即可确定未知物的种类。或用 仪器联用技术如 GC-IR,GC-MS,LC-MS等进 行结构分析。 二、定量分析 在一定色谱条件下，组分 i的质量（ mi） 或其在流动相中的浓度与检测器响应信号 （峰高或峰面积）呈正比。 色谱定量分析依据 ， 绝对校正因子 （一）响应信号的测量 1.峰高 h：峰顶与基线之间的距离。 2.峰面积的测量 自动积分仪 手工测量 A=1.065hY1/2 A=1/2h(y0.15+y0.85) （二）定量校正因子 色谱定量依据是被测组分的质量与其峰面 积成正比。但峰面积的大小不仅取决于组 分的质量，而且还与它的性质有关。即当 两个质量相同的不同组分在相同色谱条件 下，测得的峰面积（即检测器产生的响应 信号）不一定相同。为了使色谱峰面积能 真实地反映出物质的质量，就要对峰面积 进行校正，即引入定量校正因子。 1.绝对校正因子 绝对校正因子， 也就是单位峰面积所代表 物质的质量 。 绝对校正因子主要由仪器的 灵敏度所决定，它既不易测定，也无法直 接应用 。 因此在定量工作中都是用相对校 正因子。 2.相对校正因子 相对校正因子是指组分 (i)与基准组分 (s)的 绝对校正因子之比。 常用的基准物，对热导检测器是苯，对氢 火焰检测器是正庚烷。 一些化合物的相对校正因子 化合物 沸点 热导检测 器 /fM 热导检测 器 /fm 氢 火焰 检 测 器 /fm 甲 烷 丙 烷 乙 烯 苯 甲苯 乙醇 丙 酮 -160 -42 -104 80 110 78 56 2.80 1.55 2.08 1.00 0.86 1.39 1.16 0.45 0.68 0.59 0.78 0.79 0.64 0.68 1.03 1.02 0.98 0.89 0.94 2.18 2.04 注：相对校正因子是无因次量，但其值与 采用的计量单位有关。使用时可从相关文 献查阅。 （三）定量方法 1.外标法 (external standard method) 2.内标法 (internal standard method) 3.归一化法 (normallization method) Michael Tswett(1872-1919), a Russian botanist , discovered the basic principles of column chromatography. He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. Th