生物工艺学

生物工艺学 主讲：河南大学生命科学学院 杨生玉 E-mail: 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 第九章 生物反应动力学 及过程分析 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 第一节 微生物反应过程概论 一、微生物反应过程的主要特征 微生物是该反应过程的主体：是生物 催化剂，又是一微小的反应容器。 微生物反应的本质是复杂的酶催化反 应体系。酶能够进行再生产。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 微生物反应是非常复杂的反应过程 （ 1）反应体系中有细胞的生长，基质消 耗和产物的生成，有各自的最佳反应条件 。 （ 2）微生物反应有多种代谢途径。 （ 3）微生物反应过程中，细胞形态、组 成要经历生长、繁殖、维持、死亡等若干 阶段，不同菌龄，有不同的活性。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 二、微生物反应动力学的描述方法 细胞生长动力学 反应基质消耗动力学 代谢产物生成动力学 发酵过程：包括细胞内的生化反应， 胞内与胞外的物质交换，胞外物质传 递及反应。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 发酵过程特点 多 相：气相、液相和固相 多组分：培养基中多种营养成分，多种 代谢产物，细胞内也具有不同生理功能 的大、中、小分子化合物。 非线性：细胞代谢过程用非线性方程描 述。 复杂群体的生命活动 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 反应动力学描述的简化 动力学是对细胞群体的动力学行为的描述 不考虑细胞之间的差别，而是取性质上的平 均值，在此基础上建立的模型称为确定论模 型，如果考试每个细胞之间的差别，则建立 的模型为概率论模型。 如果在考虑细胞组成变化的基础上建立的模 型，称为结构模型，一般选取 RNA、 DNA、 糖 类及蛋白含量做为过程变量。菌体视为单组 分的模型为非结构模型，通过物料平衡建立 超经验或半经验的关联模型。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 如果细胞内的各种成分均以相同的比例增加 ，称为均衡生长。 如果由于各组分的合成速率不同而使各组分 增加比例不同，称为非均衡生长。 生长模型的简化考虑一般采用均衡生长的非 结构模型。 将细胞作为与培养液分离的生物相处理所建 立的模型为分离化模型。在细胞浓度很高时 采用。 如果把细胞和培养液视为一相，建立的模型 为均一化模型。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 非结构模型 结构模型 确定论模型 最理想情况 不考虑细胞内部结构 各种细胞均一 细胞群体做为一种溶质 A 细胞之间无差异， 是均一的，细胞内 有多个组分存在。 B 均衡 生长 概率论模型 不考虑细胞内部结构 各种细胞不均一 C 实际情况： 细胞内多组分； 细胞之间不均一 D 均衡 生长 对 细胞群体的描述模型 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 发酵动力学中常用的几个术语 1得率 (或产率，转化率， Y)： 包括 生长得率 (Yx/s)和产物得率 (Yp/s)。 得率：是指被消耗的物质和所合成产 物之间的量的关系。 生长得率：是指每消耗 1g(或 mo1)基质 (一般指碳源 )所产生的菌体重 (g)，即 Yx/s=X/S 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 产物得率：是指每消耗 1g(或 mo1)基质所合 成的产物 g数 (或 mol数 )。这里消耗的基质是指 被微生物实际利用掉的基质数量，即投入的 基数减去残留的基质量 (S。 -S)。 转化率：往往是指投入的原料与合成产物数 量之比。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 提高微生物生长得率的措施 首先，要筛选优良的菌种，其本身就应具备 高的生长得率。 其二，要选择合适的培养基配方，提供略微 过量的其它营养物质，使碳源成为最终的限 制性物质。 其三，还须选择和控制合适的培养条件，使 得微生物的代谢按所需方向进行。 另外，在发酵的操作过程中要尽量防止杂菌 污染。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 2基质比消耗速率 (qs ， g(或 mo1) g菌 体 h) ： 系指每克菌体在一小时内消耗营 养物质的量 。 它表示细胞对营养物质利用 的速率或效率。 在比较不同微生物的发酵效率上这个参数很 有用 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 3产物比生产速率 (qp， g(或 mo1) g菌 体 h) ： 系指每克菌体在一小时内合成产 物的量，它表示细胞合成产物的速度或能 力，可以作为判断微生物合成代谢产物的 效率。 4发酵周期：实验周期是指接种开始至 培养结束放罐这段时间。 但在工业生产上计算劳动生产率 时则还应把发酵罐的清洗、投料、灭菌、 冷却等辅助时间也计算在内。即从第一罐 接种经发酵结束至第二次接种为止这段时 间为一个发酵周期，这样才能正确反映发 酵设备的利用效率。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 工业发酵的技术经济指标 一、容量产率和产物形成的比速率 容量产率指的是单位时间内单位反应器容积 的产物。 计算产率时，不仅应把合成产物所用时间考 虑进去，还应计入与生产相关的其他时间， 即发酵罐的维修、清洗、准备所用时间，灭 菌时间，以及接种后的延滞期时间，这样才 能全面、客观地评估出工艺过程的成本效益 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分 批 发 酵 的 容 量 产 率 产物形成曲线的切线表示的是最大容量产率；连接原 点和产物 形成曲线终点的连线其斜率表示的是总的平均容量产率。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 研究发酵动力学的步骤 1. 为了获得发酵过程变化的第一手资料， 要尽可能寻找能反映过程变化的各种理化参 数。 2. 将各种参数变化和现象与发酵代谢规律 联系起来，找出它们之间的相互关系和变化 规律。 3. 建立各种数学模型以描述各参数随时间 变化的关系。 4. 通过计算机的在线控制，反复验证各种 模型的可行性与适用范围。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 发酵动力学的研究内容 主要包括：细胞生长和死亡动力学， 基质消耗动力学，氧消耗动力学， CO2 生成动力学，产物合成和降解动力学 ，代谢热生成动力学等。 以上各方面不是孤立的，而是既相互 依赖又相互制约，构成错综复杂、丰 富多彩的发酵动力学体系 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 过程控制和监测 Sugar consumption pH Temperature Fermentation time (h) Agitation Cell Dry Weight Product 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 发酵动力学内容及目的 发酵动力学： 是研究发酵过程中菌体 生长、基质消耗、产物生成的动态平 衡及其内在规律。 研究内容： 包括了解发酵过程中菌体 生长速率、基质消耗速率和产物生成 速率的相互关系，环境因素对三者的 影响，以及影响其反应速度的条件。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 研究发酵动力学的目的 （ 1） 确定最佳发酵工艺条件 （ 2）建立发酵过程中菌体浓度、基质 浓度、温度、 pH、 溶氧等工艺参数的控 制方案 （ 3）可在此研究基础上进行优选。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 发酵动力学的作用 要进行合理的发酵过程设计，必须以发酵动 力学模型作为依据。 目前国内外正利用电子计算机，根据发酵动 力学模型来设计程序，模拟最优化的工艺流 程和发酵工艺参数，从而使生产控制达到最 优化。 发酵动力学的研究正在为试验工厂数据的放 大、为分批发酵过渡到连续发酵提供理论依 据。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 第二节 发酵动力学分类 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 一、根据细胞生长与产物形 成有否偶联进行分类 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 细胞浓度 (x)或产物浓度对时间作图时 ，两者密切平行，其最大的比生长速 率和最大的产物合成比速率出现在同 一时刻。一般来说在这种类型的发酵 生产中，控制好最佳生长条件就可获 得产物合成的最适条件。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 1生长产物合成偶联型：也称 型。这种发 酵类型的特点是： 微生物的生长和糖的利用与产物合成直接相 关连。 产物的形成与生长是平行的。 产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系 ，而且生长与营养物的消耗成准定量关系。 这种类型的产物主要是葡萄 糖代谢的初级中 间产物，如乙醇发酵就属于此类型。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 2生产与产物合成非偶联类型：多数次 生代谢产物的发酵属这种类型，如各种抗 生素和微生物毒素等物质的生产速率很难 与生长相联系。产物合成速度与碳源利用 也不存在定量关系。 一般产物的合成是在菌体的浓度接近或达 到最高之后才开始的，此时比生长速率已 不处于最高速率。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 3生长产物合成半偶联类型：亦称 型。 它是介于生长产物合成偶联型与生长产物合 成非偶联之间的中间类型，产物的合成存在 着与生长相联和不相联两个部分。 该类型的动力学产物合成比速率的最高时刻 要迟于比生长速率最高时刻的到来 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 二、根据产物形成与基质消 耗的关系分类 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (1)类型 产物的形成直接与基质 (糖类 )的消耗有关 ，这是一种产物合成与利用 糖类有化学计量 关系 的发酵，糖提供了生长所需的能量。 糖耗速度与产物合成速度的变化是平行的， 如利用酵母菌的酒精发酵和酵母菌的好气生 长。 在厌氧条件下，酵母菌生长和产物合成是平 行的过程；在通气条件下培养酵母时，底物 消耗的速度和菌体细胞合成的速度是平行的 。这种形式也叫 做有生长联系的培养。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (2)类型 产物的形成间接与基质 (糖 类 )的消耗有关，例如柠檬酸、谷氨酸发 酵等。 即微生物生长和产物合成是分开的，糖 分既供应生长所需能量，又充作产物合 成的碳源。 但在发酵过程中有两个时期对糖的利用 最为迅速，一个是 最高生长时期，另一 个是最大产物合成时期 。 如在用黑曲霉生产柠檬酸的过程中，发 酵早期糖被用于满足菌体生长，直到其 他营养成分耗尽为止；然后代谢进入使 柠檬酸积累的阶段，产物积累的数量与 利用糖分数量有关，这一过程仅得到少 量的能量 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (3)类型 产物的形成显然与基 质 (糖类 )的消耗无关，例如青霉素 、链霉素等抗生素发酵。 即产物是微生物的次级代谢产物， 其特征是产物合成与利用碳源无准 量关系。产物合成在菌体生长停止 及底物被消耗完以后才开始。此种 培养类型也叫做无生长联系的培养 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 三、根据反应形式分类 (1)简单反应型 营养成分以固定的化学 量转化为产物，没有中间物积聚。又可分 为有生长偶联和无生长偶联两类。 (2)并行反应型 营养成分以不定的化学 量转化为产物，在反应过程中产生一种以 上的产物，而且这些产物的生成速率随营 养成分的浓度而异，同时没有中间物积聚 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (4)分段反应型 其营养成分在转化为产物 之前全部转变为中间物，或营养成分以优先 顺序选择性地转化为产物。反应过程是由两 个简单反应段组成，这两段反应由酶诱导调 节。 (5)复合型 大多数发酵过程是一个联 合反应，它们的联合可能相当复杂。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (3) 串联反应型 是指在形成产物之前积累一 定程度的中间物的反应。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 第三节 微生物生长动力学 微生物培养过程根据培养条件要求分为好 氧培养和厌氧培养。 好氧发酵有液体表面培养，在多孔或颗粒 状固体培养基表面上培养和通氧深层培养 几种方法。 厌氧发酵采用不通氧的深层培养。 无论好氧与厌氧发酵都可以通过深层培养 来实现，这种培养均在具有一定径高比的 圆柱形发酵罐内完成。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (1)分批式操作 底物一次装入罐内，在 适宜条件下接种进行反应，经过一定时间 后将全部反应系取出。 (2)半分批式操作 也称流加式操作。是指 先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下 接种使反应开始。反应过程中，将特定的 限制性底物送入反应器，以控制罐内限制 性底物浓度保持一定，反应终止取出反应 系。 (3)反复分批式操作 分批操作完成后取出 部分反应系，剩余部分重新加入底物，再 按分批式操作进行。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (4)反复半分批式操作 流加操作完成后 ，取出部分反应系，剩余部分重新加入一 定量底物，再按流加式操作进行。 (5)连续式操作 反应开始后，一方面把 底物连续地供给到反应器中，另一方面又 把反应液连续不断地取出，使反应条件不 随时间变化。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 一、 分批发酵法 发酵工业中常见的分批方法是采用单罐 深层培养法，每一个分批发酵过程都经历 接种，生长繁殖，菌体衰老进而结束发酵 ，最终提取出产物。 这一过程中在某些培养液的条件支配下， 微生物经历着由生到死的一系列变化阶段 ，在各个变化的进程中都受到菌体本身特 性的制约，也受周围环境的影响。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批发酵的特点 微生物所处的环境是不断变化的 可进行少量多品种的发酵生产 发生杂菌污染能够很容易终止操作 . 当运转条件发生变化或需要生产新产品时 ，易改变处理对策 对原料组成要求较粗放 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批培养过程中细菌生长曲线：可分为调 整期、对数生长期、平衡期和衰亡期四个 阶段。 研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛 的对数生长期细胞。 在发酵工业生产中，使用的种子应处于对 数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养 基时，几乎不出现调整期，这样可在短时 间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩 短生产周期。 在研究和生产中，时常需要延长细胞对数 生长阶段 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批培养条件下微生物的生长曲线 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (一 ) 延滞期 把微生物从一种培养基中转接到另一培养基 的最初一段时间里，尽管微生物细胞的重量 有所增加，但细胞的数量没有增加。这段时 间称之为延滞期。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 延滞期 细胞特点： 细胞本身面临着一系列的变化，如 PH值的 改变、营养物质供给增加等。因而，延滞 期的微生物主要是适应新的环境，让细胞 内部对新环境作出充分反应和调节，从而 适应新的环境。 从生理学的角度来说， 延滞期是活跃地进 行生物合成的时期 。微生物细胞将释放必 需的辅助因子，合成出适应新环境的酶系 ，为将来的增殖作准备。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 延滞期长短的因素 接种材料的生理状态，如果接种物正处于 指数生长期，则延滞期可能根本就不出现 ，微生物在新的培养基中迅速开始生长繁 殖，如果接种物在原培养基中已将营养成 分消耗殆尽，则要花费较长时间来适应新 培养基。 培养基的组成和培养条件也可影响延滞期 的长短。 接种物的浓度对延滞期长短也有一定影响 ，加大接种浓度可相应缩短延滞期。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 延滞期长短对发酵结果的影响 种子培养基和培养条件必须合适，只有这样 才能获得高的产量。 接种后延滞期的长短关系到发酵周期的长短 ，而与产物形成速率和产率并无必然联系。 实际生产过程中，为缩短发酵周期、提高设 备利用宰、提高体积生产率，就必须尽可能 地缩短延滞期。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 解决途径： 一是尽量选择处于指数生长期的种子； 二是扩大接种量。但是，如果要扩大接种量 ，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了 发酵的复杂程度，又容易造成杂菌污染，故 而应从多方面考虑。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (二 )指数生长期 对细菌、酵母等单细胞微生物来讲，单位 时间内其细胞数目将成倍增加。 而对于丝状微生物而言，单位时间内其 生 物量将加倍 。 此时，如以细胞数目或生物量的对数对时 间作一对数图，将得一直线，因而这一时 期称作指数生长期。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 指数生长期细胞特点 细胞保持均恒生长。 不断吸收培养基中的营养成分以合成自身 物质，并不断向培养基中分泌代谢产物。 由于此时培养基中的 营养成分远远过量 ， 且积累的代谢产物尚不足以抑制微生物本 身的生长繁殖，因而微生物的生长速率不 受这些因素的影响，而仅与 微生物本身的 比生长速率 及发酵液中的生物量浓度 X(g/L)相关。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 对于单细胞的微生物来说，还可进一步简 化为 N 培养基中的细胞密度。 对于特定的微生物而言，其比生长速率 只与三个因素有 关。限制性营养物质的浓度、最大比生长速率 m、 底物 相关常数 Ks。 假定营养物质进入细胞后，立即被利用而不积累，则存 在以下关系式： Ks一一底物相关常效，为 为 1/2m时限制性营养物质的浓度 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 如果各种营养物质均大大过量的话，则 =m ， 这时便是指数生长期。也就是说 ，处于指数生长期的微生物 ,其生长繁殖 不受营养物质的限制，因而具有最大比生 长速率。如果发酵的目的是为了获得微生 物菌体的话，则应尽量设法维持指数生长 期。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 微生物的最大比生长速率在工业上的意义 为保证工业发酵的正常周期，要尽可能地使 微生物的比生长速率接近其最大值。 最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有 关，也与所消耗的底物以及培养的方式有关 。 限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养 物质的浓度，而是 营养物质进入细胞的速度 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (三 )稳定期 在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物 不断被消耗，一些对微生物生长代谢 有害 的物质在不断积累 。受此影响，微生物的 生长速率和比生长速率就会逐渐下降，直 至完全停止，这时就进入稳定期。 处于稳定期的生物量增加十分缓慢或基本 不变； 但微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着， 细胞的组成物质还在不断变化。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 此时，有的细胞开始老化、裂解，形成 芽孢，并向培养基中释放出新的碳水化 合物和蛋白质等，这些物质可以用来维 持生存下来的细胞的缓慢生长。 微生物的很多代谢产物，尤其是次级代 谢产物，是在进入稳定期后才大量合成 和分泌的。 当微生物赖以生存的培养基中存在多种营 养 物质时，微生物将优先利用其易于代谢的 营养物质，至其耗用完时，降解利用其他营养 物质的酶才能诱导合成或解除抑制。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (四 )死亡期 在死亡期，细胞的营养物质和能源储备已消 耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因 而细胞开始死亡。 这时，以生存细胞的数目的对数对时间作半 对数图，可得一直线，这说明微生物细胞的 死亡呈指数比率增加。 在发酵工业生产中在进入死亡期之前应及 时将发酵液放罐处理。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批发酵产物形成的动力学 (一 )生产连动型产物形成 (I型发酵 ) 生产连动型产物通常都直接涉及微生物的产 能降解代谢途径，或是正常的中间代谢产物 。 酵母发酵生成酒精，以及葡萄糖酸和大部分 氨基酸、单细胞蛋白都属于这种类型。 在这种类型的发酵中，微生物的生长、碳水 化合物的降解代谢和产物的形成几乎是平行 进行的，营养期和分化期彼此不分开。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批生物工艺中各种比速率 (生长速率 、 基质消耗 qk和 产物形成 qp)之间关系的图示 生产连动型 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 生产连动型产物的生成反应可表示如下 ： 生产连动型产物的合成速率与微生物的比生长速率以及培养基中 的菌体浓度呈正比。 产物形成的比速率则与微生物的比生长速率呈正比。 所以，对于这种类型的产物来说，调整发酵工艺参数，使 微生物 保持高的比生长速率 ，对于快速获得产物、缩短发酵周期十分有 利。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (二 )部分生长连动型产物形成 (II型发酵 ) 部分生长连动型产物又称混合型产物，它们 通常都间接地与微生物的初级产能代谢途径 相关，是由产能代谢派生的代谢途径产生的 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 其生成反应可表示为； 柠檬酸、衣糠酸、乳酸和部分氨基酸为这种类型产 物的典型代表。 在分批发酵中，这种类型产物的形成分成两个极 限：起初，微生物消耗大量底物用于产能代谢和生长 ，而产物形成很缓馒，甚至根本不形成； 此后， 当微生物的生长速率开始减慢后，细胞开始 大量消耗底物以合成产物 。 对这类产物来说， 营养期和分化期在时间上是彼此 分开的 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批生物工艺中各种比速率 (生长速率 、 基质消耗 qk和产物形成 qp) 之间关系的图示 (b)部分生长连动型 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 产物的形成只与发酵被中的菌体浓度有关， 而微生物的生长速率对它无直接影响。 对于这一类型发酵，只要能 保证获得足够高 浓度的生物量 ，就可以获得高速率的产物合 成。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (三 )非生长连动型产物形成 ( 型 发酸 ) 非生长连动型的产物一般不是直接或间接来 自微生物的产能降解代谢，而是通过两用代 谢途径合成的。 在这一类型的发酵中，起初是微生物的初级 代谢和菌体生长，而没有产物的合成。此时 ，营养物质的消耗非常大。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 当培养基中的营养物质消耗尽、微生物的生 长停止以后，产物才开始通过中间代谢大量 合成。即产生该类产物的微生物，其 营养期 和分化期在时间上是完全分开的 。 非生产连动型的产物大多数是微生物的次级 代谢产物，大多数的抗生素和生物毒素，以 及维生素类。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批生物工艺中各种比速率 (生长速率 、 基质消耗 qk和产物形成 qp)之间关系的图示 c)非生长连动型 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 二、分批补料培养技术 在传统的分批培养发酵工艺中，所有的 物料都是在发酵开始前加入反应器中的。 一般来说，微生物生长所需要的营养物质浓 度并不十分高，往往在 10Ks以上时就可达到 最大比生长速率。在此基础上，即使营养物 质浓度再进一步提高，比生长速率也不会再 增加了。 然而，在分批发酵工艺中，低浓度培养基中 的营养物质会迅速耗尽，引起微生物过早地 从指数生长期向稳定期转变，这样，设备的 利用率和产物的积累浓度都不高。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 高 底物浓度的缺点 提高底物浓度可以延长微生物的指数 生长期，从而提高发酵的设备利用率 、容积产量和产物的积累浓度； 但过高的底物浓度往往会引起一系列 的不利影响，如底物抑制、粘度升高 引起的传质效率降低等。 尤为严重的是，微生物的许多次级代 谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖 、碳水化合物以及含氮化合物的降解 产物的抑制。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 所谓分批补料培养技术，就是指在分批培 养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵 过程中，当 微生物开始消耗底物 后，再以某 种方式向培养系统中补加一定的物料， 使培 养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定 范围内 ，以维持微生物的生长和产物的形成 ，并避免不利因素的产生，从而达到提高容 积产量、产物浓度和产物得率的目的。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 分批补料培养特点 分批补料培养技术是介于分批培养相连续培 养之间的一种发酵技术。 由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料， 分批补料系统不再是一个封闭的系统。 分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液 ，因而发酵罐内的 培养基体积不再是个常数 ，而是随时间和物料流速而变化的变量。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 补料分批发酵法 与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵 系统中维持很低的基质浓度。 低基质浓度的优点为： 可以除去快速利 用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓 度，使不致于加剧供氧的矛盾。 避免培 养基积累有毒代谢物。 适用范围：补料分批发酵广泛应用于抗生 素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸及 高聚物等的生产。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 四、连续培养技术 与在密闭系统中进行的分批培养相反，连续 培养是在开放系统中进行的。 所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液 中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流 出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定 不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培 养方法。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (三 )连续发酵法 从系统外部予以调整，使菌体维持在 衡定生长速度下进行连续生长和发酵 。 要维持这一衡定的速度，必须使发酵 罐中发酵液的稀释度，恰恰等于该微 生物的生长速度。 大大提高了发酵的生长效率和设备利 用率。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 恒定状态可以有效地延长分批培养中的指 数生长期。在恒定的状态下，微生物所处的环 境条件，如营养物质浓度、产物浓度、 pH值， 以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始 终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长 速率。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 连续培养的工艺种类 1均匀混合的生物反应器 在这种反应器中，培养基经搅拌而混合均匀 ，反应器中的各部分培养基间不存在浓度梯 度。这种连续培养装置又可进一步分为恒化 器和恒浊器两种。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (1)恒化器 是一种设法使培养液流速保 持不变，并使微生物始终在低于其最高 生长速率条件下进行生长繁殖的一种连 续培养装置。 这是一种通过控制某一种营养物的浓度 ，使其始终成为生长限制因子的条件下 达到的，因而可称为外控制式的连续培 养装置。 在恒化器中，一方面菌体密度会随时间 的增长而增高，另一方面，限制生长因 子的浓度又会随时间的增长而降低，两 者互相作用的结果，出现微生物的生长 速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速 相平衡。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 这样，既可获得一定生长速率的均一菌体 ，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持 稳定菌体密度的菌体。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (2)恒浊器 是根据培养器内微生物的生长 密度，并借光电控制系统来控制培养液流速 ，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生 物细胞的连续培养器。在这一系统中，当培 养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密 度增高，这时通过光电控制系统的调节，可 促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来 达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工 作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速 率进行生长，并可在允许范围内控制不同的 菌体密度。 在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体 生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时 ，都可以利用恒浊器。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 在恒浊器中，微生物可维持该培养在分批培 养时达到的最大生长速率。 一般来说，恒浊器较难控制，目前大多数研 究工作者都利用恒化器进行连续培养的研究 。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 群体生长速率与临界底物浓度的关系 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 2，活塞流反应器 这是一种不均一的管状反应器，培养基由反 应器的一端流入，而从另一端流出。 在这种反应器中，没有返混现象，因而，反 应器内的培养基呈极化状态，在其不同的部 位，营养物的成分、细胞数目、传质效果、 氧供应和生产量都不相同。对于这类反应器 ，在其入口处，加入物料的同时也必须加入 微生物细胞。通常是在反应器的出口处装一 支路，使细胞返回，也可以来自另一连续培 养装置 (种子供应系统 )。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 恒化器 (A)、 恒浊器 (B)和活塞流反应器 (c)中的连续发酵 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 另外，这种反应器常用于固定化菌和固定化 细胞所催化的反应，这时就无需再在进料口 处加入催化剂。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 连续培养在生产上的应用还很有限的原因 许多方法只能连续运转 20一 200小时，而工业 系统则要求必须能稳定运行 500一 1000小时以上 ； 工业生产规模长时间保持无菌状态有一定困 难； 连续培养所用培养基的组成要保持相对稳定 ，这样才能取得最大产量，而工业培养基的组 成成分，如玉米浆、蛋白胨和淀粉等，在批与 批之间有时会出现较大变化； 当使用高产菌株进行生产时，回复突变可能 发生。在连续培养过程中，回复突变的菌株有 可能会取代生产菌株而成为优势菌株。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 连续发酵分类 开放式连续发酵系统 ：单罐均匀混 合连续发酵、多罐均匀混合连续发酵、 管道非均匀混合连续发酵、塔式非均匀 混合连续发酵 封闭式连续发酵系统： 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 连续发酵类型 类 型 开放式 (菌体取出 ) 封闭式 (菌体不取出 ) 单罐 多罐 单罐 多罐 均 匀 混 合 非 循 环 搅拌发酵 罐 搅拌罐 (串联 ) 透析膜培养 循 环 搅拌发酵 罐 (菌体部 分重复使 用 ) 搅拌罐串联 (菌 体部分重复使 用 ) 搅拌发酵罐 ( 菌体 100重 复使用 ) 搅拌发酵罐 串联 (菌体 100重复 使用 ) 非 均 匀 混 合 非 循 环 管道发酵 器塔式发 酵罐 塔式发酵罐装 有隔板的管道 发酵器 (卧式、 立式 ) 塔式发酵罐 ( 菌体 100重 复使用 ) 塔式发酵罐 ( 菌体 100 重复使用 ) 循 环 管道发酵 器塔式发 酵罐 (菌体 部分重复 使用 ) 塔式发酵罐装 有隔板的管道 发酵器 (菌体部 分重复使用 ) 管道发酵器 ( 菌体 100重 复使用 ) 塔式发酵罐 装有隔板的 管道 (菌体 100重复 使用 ) 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 1开放式连续发酵 在开放式连续发酵系统中，培养系统中的 微生物细胞随着发酵液的流出而一起流出 ，细胞流出速度等于新细胞形成速度。因 此在这种情况下，可使细胞浓度处于某种 稳定状态。 另外，最后流出的发酵液如部分返回 (反馈 )发酵罐进行重复使用，则该装置叫做循环 系统，发酵液不重复使用的装置叫做不循 环系统。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (1)单罐均匀混合连续发酵：培养液以一 定的流速不断地流加到带机械搅拌的发酵 罐中，与罐内发酵液充分混合，同时带有 细胞和产物的发酵液又以同样流速连续流 出。如果用一个装置将流出的发酵液中部 分细胞返回发酵罐，就构成循环系统。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (2)多罐均匀混合连续发酵：将若干搅 拌发酵罐串联起来，就构成多罐均匀 混合连续发酵装置。新鲜培养液不断 流人第一只发酵罐，发酵液以同样流 速依次流人下一只发酵罐，在最后一 只罐中流出。多级连续发酵可以在每 个罐中控制不同的环境条件以满足微 生物生长各阶段的不同需要，并能使 培养液中的营养成分得到较充分的利 用，最后流出的发酵液中细胞和产物 的浓度较高，所以是最经济的连续方 法。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (3)管道非均匀混合连续发酵：管道的形 式有多种，如直线形、 S形、蛇形管等。 培养液和从种子罐来的种子不断流入管道 发酵器内，使微生物在其中生长。 这种连续发酵的方法主要用于厌氧发酵。 如在管道中用隔板加以分隔，每一个分隔 等于一台发酵罐，就相当于多罐串联的连 续发酵。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 (4)塔式非均匀混合连续发酵： 塔式发酵罐有两种：一种是用多孔板将 其分隔成若干室，每个室等于一台发酵罐 ，这样一台多孔板塔式发酵罐就相当于一 组多级串联的连续发酵装置。另一种是在 罐内装设填充物，使菌体在上面生长，这 种形式仍然属于单罐式。 河 南 大 学 生 物 工 艺 学 2封闭式连续发酵 在封闭式连续发酵系统中，运用某种方法 使细胞一直保持在培养器内，并使其数量 不断增加。这种条件下，某些限制因素在 培养器中发生变化，最后大部分细胞死亡 。因此在这种系统中，不可能维持稳定状 态。 封闭式连续发酵可以用开放式连续发酵设 备加以改装，只要使全部菌体重新循环使 用。 另一种方法是采用间隔物或填充物置于设 备内，使菌体在上面生长，发酵液流出时 不带细胞或所带细胞极少。 河 南