荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青

Instrumental Analysis荧光分析法现代表征方法与技术现代表征方法与技术 -Fluorescence Analysis 1Instrumental Analysis 荧光分析法 第三版许金钩、王尊本主编，科学出版社参考书 Principles of Fluorescence Spectroscopy (II、 III),J. R. Laowisz, Kluwer Academic/Plenum Publisher 2Instrumental Analysis一、 分子荧光的产生过 程二、 荧光的产生与分子结构的关系 三、 影响荧光强度的因素第一节 分子荧光原理 Principle of Fluorescence3Instrumental Analysis一、 仪器与结构流程二、 激发光谱与荧光光谱三 、 荧光分析法和应用第二节 分子荧光分析法Fluorescence Analysis 4Instrumental Analysis一、荧光的产生过程Luminescence Process of Molecular Fluorescence* 分子能级 比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级；* 基态 激发态 ： 吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；* 激发态 基态 ：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；1. 分子能级与跃迁5Instrumental Analysis2.电子激发态的多重度* 大多数有机分子的 基态 处于单重态；* 电子 激发态 有 单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向M=2S+1， S为电子自旋量子数的代数和 (0或 1)；* 根据洪特规则，平行自旋（ 三重态 ）比成对自旋（ 单重态 ）稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低； S0 T1 属于禁阻跃迁，需要通过其他途径进入，而且进入的几率小； 6Instrumental Analysis3.激发态 基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁 (发光 )和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光 磷光 内转换 外转换系间窜越 振动弛豫无辐射跃迁7S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换 振动弛豫能量l 2l 1l 3外转换l 2T2内转换振动弛豫8Instrumental Analysis非辐射能量传递过程振动弛豫 ：同一 电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间 10-12s。内转换 ：同多重态电子能级中 ,不同能级间的无辐射能级交换通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换 ：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “猝灭 ”。系间窜跃 ：不同多重态 ,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。9Instrumental Analysis辐射能量传递过程S0 激发 振动弛豫 内转移 系间窜跃 振动弛豫 T1S0磷光发射 ： 电子由第一激发 三重态 的最低振动能级 基态（ T1 S0跃迁 ）；电子由 S0进入 T1的可能过程：发光速度很慢： 10-4 10 s ，即光照停止后，可持续一段时间。荧光发射 ： 第一激发 单重态 的最低振动能级 基态（ S1 S0跃迁 ） 10-7 10 -9s（ S0 T1禁阻跃迁）10Instrumental Analysis速率竞争决定光活化电子能量迁移的途径！荧光的光物理本质11Instrumental Analysis二、荧光的产生与分子结构的关系Relation Between Fluorescence and Molecular Structure1. 荧光量子产率荧光量子产率荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；kF主要取决于化学结构，而 Ski则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。大多数荧光物质的量子产率在 0.11之间。12Instrumental Analysis2.有机化合物的结构与荧光（ 1） 跃迁类型 ： * 的荧光效率高。这是因为 * 跃迁的摩尔吸收系数比 n *大，且 *跃迁的寿命比 n *要短。（ 2） 共轭效应 ：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。（ 3） 刚性平面结构 ：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（ 4） 取代基效应 ：芳环上有供电基，使荧光增强。重原子效应。13Instrumental Analysis 14Instrumental Analysis强荧光物质往往具备以下特征： 具有大的共轭 键结构； 具有刚性平面结构； 具有最低的单线电子激发态 S1为 *型 取代基团为给电子取代基小结：15Instrumental Analysis1.荧光强度和溶液浓度的关系荧光强度 If正比于体系吸收的激发光的光强，即 ：If = K( I0 - I )由朗 -比耳定律： I / I0= 10- b c代入 ，得： If = KI0(1-10- b c )将此式展开，即三、影响荧光强度的因素 低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。浓度很低时， bc 13 无荧光18Instrumental Analysis自吸现象 ：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。碰撞猝灭 是荧光熄灭的主要原因。5.荧光的熄灭氧的熄灭作用等。浓度越大、温度越高，碰撞机会越大粘度越大，碰撞机会越小19Instrumental Analysis一、仪器结构流程测量荧光的仪器主要由 五个部分 组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录装置。特点 ： （ 与 UV-vis仪器的比较 ） 有两个单色器，光源与检测器通常成直角。两个单色器分别是：1）选择激发光波长的第一单色器2）选择发射光 (测量 )波长的第二单色器20Instrumental Analysis 21Instrumental Analysis检测器 ： 光电倍增管。样品池 ：材料：与 UV-vis吸收池相同。形状： ？光源 ： 氙灯和高压汞灯，染料激光器 (可见与紫外区 )氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围： 200700nm, 在 200400nm波段内，光谱强度几乎相等。22Instrumental Analysis仪器光路图23Instrumental Analysis二、激发光谱与荧光光谱Excitation Spectrum and Fluorescence SpectrumIf ex (固定 em)光源第一单色器第二单色器激发荧光样品池检测系统1.荧光的激发光谱曲线2.荧光的发射光谱曲线（荧光光谱）If em (固定 ex)24Instrumental Analysis粗步设定 ex， 扫描 em萘的激发、荧光光谱exem相对强度固定 em（最佳）， 扫描 ex固定 ex（最佳）， 扫描 em荧光（发射）光谱曲线 I I荧光激发光谱曲线 II荧光（发射）光谱曲线 IIIII III25Instrumental Analysis3.激发光谱与发射光谱的关系(1) Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值 。 发射光谱的波长比激发光谱的长， 振动弛豫消耗了能量。(2) 发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 ， 产生不同吸收带， 但均回到 第一激发单重态的最低振动能级 再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 26Instrumental Analysis4. 测定波长的选择瑞利散色和拉曼散色27Instrumental Analysis三、荧光分析方法与应用1. 特点（ 1） 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。（ 2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（ 3）试样量少，应用范围广 。（ 4）灵敏度高分析物浓度范围： 10-5 10-8 mol/L，检测下限： 0.1 0.1g/cm-3比紫外 -可见分光光度法高 2 4个数量级。28Instrumental Analysis(1)定性方法 任何荧光都具有两种特征光谱： 激发光谱 与 发射光谱 。它们是荧光定性分析的基础。(2)定量 方法 If = 2