分子生物学教案

1第一章 绪论重点：1. 分子生物学的基本含义2. DNA 的发现3. 分子生物学与其他学科的关系难点：DNA 的发现课时分配：1.5 学时分子生物学的基本含义分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、 生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。1.1 引言现代分子生物学研究的目标是要在分子水平上掌握细胞的功能并揭2示生命是本质。1.1.1 创世说与进化论多少年来，人们常常会反复提出下面 3 个与生命和一切生物学现象有关的问题：（1）生命是怎样起源的？（2）为什么“有其父必有其子”？（3）动、植物是怎样从一个受精卵发育而来的？对这些问题的回答：创世说：西方：上帝先创造了世间万物，后来又创造了男人亚当，再从亚当身上抽一根肋骨，这就成了女人夏娃，亚当和夏娃繁衍了人类。中国：女娲团土造人进化论：1859 年，伟大的英国生物学家达尔文（Charles Darwin）发表了著名的物种起源一书，确立了进化论的观点。正是达尔文的生物进化学说，打破了上帝造人的传统观念，改变了社会对人类在整个世界中的地位的看法，极大地推动了人类思想的发展。达尔文用大量事实证明“物竟天择，适者生存”的进化论思想，他认为世界上的一切生物都是可变的，并预言从低级到高级的变化中必定有过渡物种存在。他指出物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的，彻底否定了上帝创造万物的旧思想，推翻了物种不变的神话，使生物学真正迈入实证自然科学的行列。1.1.2 细胞学说早期生物科学家的另一大贡献是提出细胞理论（Cell Theory） 。17 世纪末，荷兰籍显微镜专家 Leeuwenhoek 成功制作了世界上第一架显微镜。大约与 Leeuwenhoek 同时代的 Hooke，第一次用“细胞”这个概念来形容组成软木的最基本单元。动、植物的基本单元是细胞，这是 19 世纪三大发现之一的细胞学说的核心。建立这一学说的是德国植物学家 Schleiden 和动物学家 Schwann。1.1.3 经典的生物化学和遗传学现代生物学的两大支柱：生物化学和遗传学进化论和细胞学说相结合，产生了作为实验科学之一的现代生物学，3而以研究动、植物的遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。生物化学家 Buchner 第一个实现了用酵母无细胞液和葡萄糖进行氧化反应，生成乙醇，证明化学物质的转换并不需要完整的细胞而仅仅需要细胞中的某些成分。蛋白质是生活细胞中所有化学反应的执行者和催化剂。生物化学从一开始就执行着双重使命，首先，分析细胞的组成成分；其次，弄清楚这些物质与细胞内生命现象的联系。孟德尔通过豌豆实验，总结出生物遗传的两条基本规律基因分离规律和自由组合规律，被公认为经典遗传学的奠基人。在孟德尔遗传学的基础上，美国著名的遗传学家 Morgan 又提出了基因学说。当所研究的两个基因位于同一染色体上而距离又较近时，Morgan 的连锁遗传规律起主导作用；而当所研究的两个基因位于不同染色体上时，孟德尔的自由组合规律起主导作用。1.1.4 DNA 的发现直到 1953 年 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋模型之前，人们对于基因的理解仍然是抽象的、概念化的，缺乏准确的物质内容。首次证明 DNA 是遗传物质的是 Avery 的细菌转化实验。图 1-1 DNA 是转化源早在 1928 年，英国科学家 Griffith 等人就发现，肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面荚膜中的多糖决定的。具有光滑外表的 S 型肺炎链球菌因为带有荚膜而能使小鼠发病，具有粗糙外表的 R 型肺炎链球菌因为没有荚膜而失去致病力， （荚膜多糖使细菌免受动物白细胞的攻击） 。首次用实验证明基因就是 DNA 分子的是美国著名的微生物学家Avery。他和同事首先将光滑型致病菌（S 型）烧煮杀灭活性以后在侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病力。再用活的粗糙型细菌（R 型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌无致病力。然而，当他们将烧煮杀死的 S 型细菌和活的 R 型细菌混合再感染小鼠时，小鼠死亡。解剖死鼠，发现有大量活的 S 型细菌（而不是 R 型） 。他们推测，死细菌中的某一成分转化源将无致病力的细菌转化成致病菌。10 多年后，实验证明，DNA 就是转化源。死细菌 DNA 指导了这一可遗传的转化，从而导致了小鼠死亡。再次证明 DNA 是遗传物质的噬菌体侵染细菌的实验。图 1-24噬菌体专门寄生在细菌体内，它的头、尾外部都是由蛋白质组成的外壳，头内主要是 DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下 5 个步骤：1. 噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面，2. 噬菌体通过尾轴把 DNA 全部注入细菌细胞内，蛋白质外壳则留在细胞外。3. 噬菌体的 DNA 一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成自身的 DNA 和蛋白质。4. 新合成的 DNA 和蛋白质能组装成许许多多与亲代完全相同的子代噬菌体。5. 子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。1.2 分子生物学简史分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。1.3 分子生物学研究的内容现代生物学研究发现，所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同的方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的 20 种氨基酸及 DNA 和 RNA 中的 5 种碱基组合而成，由此产生了分子生物学的 3 条基本原理：1. 构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的。2. 生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则。3. 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。从表面上看，分子生物学涉猎范围极为广泛，研究内容似乎包罗万象。事实上，它所研究的不外乎以下四个方面：1. DNA 重组技术2. 基因表达调控3. 生物大分子的结构和功能4. 基因组、功能基因组与生物信息学分子生物学与其他学科的关系分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，凝聚了5不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”，但两者还是有区别的。生物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢，包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能量代谢等与生理功能的联系。分子生物学则着重阐明生命的本质-主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。国际生物化学学会和 中国生物化学学会现均已改名为国际生物化学与分子生物学学会和中国生物化学与分子生物学学会。细胞生物学与分子生物学关系也十分密切。传统的细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。细胞作为生物体基本的构成单位是由许多分子组成的复杂体系，光学显微镜和电子显微镜下所见到的规则结构是各种分子有序结合而形成的。探讨组成细胞的分子结构比单纯观察大体结构能更加深入认识细胞的结构与功能，因此现代细胞生物学的发展越来越多地应用分子生物学的理论和方法。分子生物学则是从研究各个生物大分子的结构入手，但各个分子不能孤立发挥作用，生命绝非组成成分的随意加和或混合，分子生物学还需要进一步研究各生物分子间的高层次组织和相互作用，尤其是细胞整体反应的分子机理，这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。分子细胞学或细胞分子生物学就因此而产生，成为人们认识生命的基础。由于分子生物学涉及认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。在医学各个学科中，包括生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理学以及临床各学科分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透，形成了一些交叉学科，如分子免疫学、分子病毒学、分子病理学和分子药理学等，大大促进了医学的发展。1.4 分子生物学展望（自学内容）6第二章 染色体与 DNA重点：1.原核生物和真核生物 DNA 的复制特点2. DNA 的修复难点：1. DNA 的修复2. DNA 的转座课时分配：3.5 学时第四节 原核生物和真核生物 DNA 的复制特点一. 原核生物 DNA 的复制特点 大肠杆菌基因组以双链环状 DNA 分子的形式存在，其 DNA 复制的之间产物可形成一个 ，复制从定点开始双向等速进行。1. 大肠杆菌 DNA 复制起始点（oriC）保守序列分布图（图 2-21）2. 由大肠杆菌 oriC 复制起始点出引发的 DNA 复制过程（a）大约有 20 个 DnaA 担保在 ATP 的作用下与 oriC 处的 4 个 9bp 保守序列相结合；（b）在 HU 蛋白和 ATP 的共同作用下，DnaA 复制起始复合物使 3X13bp 直接重复序列变性，形成开链；（c）DnaB（解链酶）六体分别与单链 DNA 相结合， （需要 DnaC 的帮助） ，进一步解开双链。在一些重要的酶和蛋白质的相互作用下，DNA 开始复制。3. 参与 DNA 复制的酶和蛋白因子（1 . ）DNA 解链酶 （Helicase）7促使 DNA 在复制叉处打开双链，与单链 DNA 结合，与 ATP 结合，分解成 ADP+Pi，产生能量沿 DNA 链向前运动，促使 DNA 双链解开。 （2）单链 DNA 结合蛋白（SSBP） 与单链 DNA 结合，防止解开的单链重新配对形成双链或被核酸酶降解;使单链 DNA 呈伸展状态，无弯曲和结节，利于作为模板；SSBP 可重复使用。原核生物的 SSBP 具有协同效应。SSBP 只保持单链的存在，并不能起解链的作用。（3）拓扑异构酶 Topoisomerase 解开负超螺旋，并与解链酶 共同作用解开双链。 （4）引物酶 Primase 催化引物 RNA 分子的合成（5）DNA 聚合酶 DNA Polymerase A.概念：是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成 DNA 的一类酶。B. 特点：a. 以 dNTP 为前体催化合成 DNA；b. 需要模板和引物；c. 催化 dNTP 加到 DNA 链的 3-OH 端；d. 催化合成方向 53 。C. 分类：DNA 聚合酶 I（主要保证 DNA 复制的准确性）DNA 聚合酶 II（主要起 DNA 修复的作用）DNA 聚合酶 III（DNA 复制的主导酶）（6）DNA 连接酶将双链 DNA 上的切口连接起来；主要用于冈崎片段的连接，DNA 修复、重组，两个复制单元间片段的连接。连接双链 DNA 的要求：切口 3 -OH5 -磷酸基团 需要能量4.冈崎片段与半不连续复制8由于 DNA 的两条链为反向平行，以复制叉移动的方向为基准，一条链为 3 5 ，其新合成的 DNA 链沿 5 3 连续进行前导链另一条链为 5 3 ，新生的 DNA 链先合成短的冈崎片段，不连续合成滞后链，再由 DNA 连接酶连接成完整的 DNA 链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制称为半不连续复制。5. 复制的引发和终止（1）引发先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物，再由 DNA 聚合酶从 RNA 引物的 3 端开始合成新的 DNA 链。滞后链的引发由引发体来完成。引发体由 6 种蛋白质 n、n 、n 、DnaB、C 和 I 共同组成。引发体在滞后链分叉的方向上移动，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的 RNA 引物， ，再由 DNA 聚合酶 III 作用合成DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。RNase H 降解 RNA 引物， DNA聚合酶 I 将缺口补齐，DNA 连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。（ 2.）终止（图 2-23）当复制叉前移，遇到 20bp 重复性终止序列（Ter）时， Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后，在拓扑异构酶 IV 的作用下使复制叉解体，释放子链 DNA。二.真核生物 DNA 的复制特点1. 与原核生物相似（1）半保留、半不连续复制（2）复制过程：引发延伸终止三个阶段（3）需要酶和蛋白因子2.与原核生物不同（1） 原核生物是单复制子，真核生物是多复制子（每条染色体上有多个复制起点） ；（2） DNA 全部复制完毕才进行第二轮复制，原核生物在第一轮复制未完成就进行第二轮复制。9（3）有 5 种 DNA 聚合酶，即聚合酶 、。 3.真核细胞 DNA 的复制调控（3 个水平）真核细胞的生活周期可以分为 4 个时期：G 1、S、G 2和 M 期。G 1是复制预备期，S 期是复制期，G 2是有丝分裂准备期，M 期为有丝分裂期。DNA复制只发生在 S 期。（1） 细胞生活周期水平调控（决定细胞停留在 G1 期 还是进入 S 期 ）许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂等都可以诱发细胞由 G1 期进入 S 期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚ADP-核糖也可诱导 DNA 复制。（2）染色体水平调控（决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在 S 期起始复制。这种有序复制的机理还不清楚。（3）复制子水平调控（决定复制的起始与否）这种调控从单细胞到多细胞生物是高度保守的。第五节 DNA 的修复1. 错配修复该系统识别母链的依据来自 Dam 甲基化酶，它能使位于 5 GATC 序列中腺苷酸的 N6 位甲基化。一旦复制叉通过复制起使点，母链就会在几秒至几分钟内被甲基化。此后，只要两条 DNA 链上出现碱基配对错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA 链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的 5 位置切开子链，再根据错误碱基相对于 DNA 切口的方向启动修复，合成新的子链片段。 （图 2-25） （a）发现碱基错配； （b）在水解 ATP 的作用下，MutS，MutL 与碱基错配位点的 DNA 双链相结合；（c）MutS-MutL 在 DNA 双链上移动，发现甲基化 DNA 后由 MutH 切开非甲基化的子链。（图 2-26）当错配碱基位于切口 3下游端时，在 Mu