流式基础原理及应用

,流式基础原理及临床应用,流式基本概念,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞术的特点,检测速度快，分析样本量大：在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个 可同时分析单个细胞的多种特征：使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确强大的分选功能：在分析的同时可以对特定群体加以分选,流式检测的样本,可检测的样本种类多样：各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液样本制备：单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）51051107cells/ml，约0.51ml，300目筛网过滤,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 ,流式细胞仪的检测信号,散射光信号,当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束 方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为 侧向角散射光信号（SSC）。,散射光信号,Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,前向角散射光信号,侧向角散射光信号,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,颗粒杂质、气泡对检测的影响,荧光信号,使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光样本制备,双色直接染色,FACSCalibur荧光检测通道,双色分析,CD19+CD3细胞(B淋巴细胞)CD3+CD19+细胞CD3CD19细胞CD3+CD19细胞(T淋巴细胞),流式数据分析形式,数据存储,FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储,FITC/PE双染样本,数据显示,直方图（Histogram）二维点图（Dot Plot）等高线图（Contour Plot）密度图（Density）三维图（3D Plot）等,单参数直方图分析,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目,双参数散点图分析,等高图和密度图,流式细胞仪的组成和工作原理,液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。,光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号,电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以列表模式存储，最终以图形形式呈现,上机检测,单色/双色/多色样本 参数调节电压阈值设门补偿,流式细胞仪的应用领域,临床研究:血液、肿瘤、药理、免疫.生物学研究：遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物.环境研究：海洋生态研究.制药工业食品工业农业畜牧业,流式细胞仪的临床应用,HLA-B27,HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病也有明显表达，如Reiters综和症、银屑病性关节炎、葡萄膜炎等使用流式细胞仪，用血量少，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%,HLA-B27,HLA-B27阴性样本,HLA-B27阳性样本,淋巴细胞及其亚群的分析,SimulSET IMK MultiTEST IMKTriTEST 3-Color ReagentMultiTEST 4-Color Reagent,淋巴细胞亚群分析,使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关NK细胞（CD3-CD16+56+），行驶免疫监控功能根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血活化T淋巴细胞：HLA-DR、CD38等,淋巴细胞免疫分型原理,荧光染料标记的单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，结合多色荧光分析，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。T淋巴细胞（CD3+）/B淋巴细胞(CD19+)/NK淋巴细胞(CD16+/CD56+)及亚群分析CD4+ T淋巴细胞绝对计数,淋巴细胞免疫分型原理,淋巴细胞为CD45强阳性，颗粒度较低的一群细胞主要有T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和 NK细胞（CD16+56+/CD3-）T淋巴细胞亚群：CD3，反映细胞免疫功能B淋巴细胞：CD19、CD20、CD22等，与体液免疫功能有关。 NK细胞：执行免疫监视功能,T淋巴细胞的免疫表型原理,T淋巴细胞分类复杂，不同类型免疫表型的T淋巴细胞的功能不同根据CD4、CD8的表达，T淋巴细胞可分为T helper/T inducer（CD3+CD4+）、T suppressor/ T cytotoxic（CD3+CD8+）H/S比值升高：自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、SLE等。 H/S比值降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。H/S比值是HIV感染病人的重要监测指标活化T淋巴细胞：HLA-DR、CD38等,SimulTEST IMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,使用双色分析试剂样本使用EDTA抗凝全血，用血量600uL使用cellquest pro软件，进行样本的获取和分析医生报告T、B、NK淋巴细胞及TH、TS百分含量和H/S比值，并报告参考值范围,SimulTEST IMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞,MultiSET全自动分析软件,FACS系列流式细胞分析仪使用的全自动淋巴细胞免疫表型检测软件外周血直接多色荧光分析，获得关于外周血中淋巴细胞各类亚型细胞的信息进行相对计数和绝对计数TruCOUNT免洗试剂设计，操作简便，减少细胞丢失质量控制保证用户定义测定管组合提高工作效率和计数的精确度,MultiSET淋巴细胞亚群绝对计数MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,实验报告Report,Laboratory Report：实验室报告，报告每个标本各实验管的分析点图FSC-SSC、FL1-FL2，计算淋巴细胞及各亚型相对含量/绝对含量，计算H/S比值Physician Report：医生报告，报告每个标本的各种淋巴细胞占总淋巴细胞的百分含量/绝对含量，并给出正常值范围Summery Report：总结报告，总结当日的SimulSET实验结果,正常参考值,百分数 绝对数CD3+T 50-84% 955-2860/ulCD3+CD4+Th 27-51% 550-1440/ulCD3+CD8+Tc 15-44% 320-1250/ulCD4/CD8 0.71-2.87 CD19 5-18% 90-560/ulCD16/56 7-40% 150-1100/ulCD3+HLA-DR+ 1.2-5.8%,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态辅助临床疾病的诊断探索疾病的发病机理、病程、预后监测、指导临床治疗方案,临床意义,自身免疫性疾病：SLE，类风湿关节炎免疫缺陷病，AIDS各种肿瘤：消化道肿瘤肿瘤病人化疗后免疫力监测各种感染：带状疱疹、慢性肝病移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测,临床意义,急性心肌梗塞：血液系统疾病：小儿再障，传染性单核细胞增多症皮肤病性病：皮炎、梅毒妇产科疾病：习惯性流产,临床意义,疾病 T 细胞亚群 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 类风关 （活动期） SLE （活动期） Sjogren综合症 多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血 ,临床意义,疾病 T 细胞亚群 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 上呼吸道感染 传染性单核细胞增多症 （急性期） 巨细胞病毒感染 乙肝 （急性期/慢性肝炎） 结核 （胸水/重症外周血）麻风 疟疾 血吸虫病 AIDS ,HIV感染,T淋巴细胞总数减少T细胞亚群比例倒置，Th/Ts1.0Th细胞(CD4+细胞)绝对计数200个/mlTs细胞增高NK细胞减少或活力下降B细胞正常,AIDS病人T亚群分析,先天性无球蛋白血症,干祖细胞的分析和分选,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。造血干细胞的特征是：大小（FSC）和颗粒度（SSC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似细胞内含有较多核酸物质CD34表达弱阳性或强阳性CD45表达弱阳性,干祖细胞的分析,细胞表型分析CD34+造血干细胞：广泛应用于人/小鼠造血干细胞分析488nm激光做多色分析Milan：CD34单色分析ISHAGE：CD45/CD34双色分析SIHON：CD14+66e /CD34/ LSD751三色分析ProCOUNT：NA/CD34/CD45三色分析，加入TruCOUNT标准微球，做造血干细胞绝对计数,ProCOUNT造血干细胞计数,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞，在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数根据造血干细胞特征，进行三色分析NA/CD34 PE/CD45 PerCP ，多重设门，准确、特异地圈定CD34+干细胞使用TruCOUNT绝对计数管，准确计算CD34+干细胞绝对含量,造血干细胞计数,传统方法（有核细胞计数、集落形成单位计数）：费时费力，与干细胞移植的数量关系不明确流式细胞术：快速得到准确的计数结果多色分析，多重设门，特异检测CD34+干细胞利用TruCOUNT绝对计数技术，准确定量，确定干细胞移植数量使用ProCOUNT自动软件，自动做质量检查，报告结果，重复性好报告CD34+细胞百分含量和绝对含量，并根据收获量和受者体重，自动计算受者每公斤体重接受的干细胞数量，帮助判断干细胞移植的最佳时间,ProCOUNT造血干细胞计数,造血干细胞计数ProCOUNT,造血干细胞计数ProCOUNT,阵发性血红蛋白尿PNH,阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血患者体内红细胞呈不均一性利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例,阵发性血红蛋白尿PNH,正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完全阳性PNH患者血细胞分为三型：型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于型与型之间 型：CD59表达完全阴性分析PNH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度,红细胞 PNH分析,A 正常人B D 病人,网织红细胞计数Retic-COUNT,操作快速、