胃癌特征性循环microRNA组合模式的建立及应用研究

胃癌特征性循环microRNA组合模式的建立及应用研究,金华市人民医院消化科 施莉,一、立项研究内容二、研究工作情况三、取得的技术、经济、社会效益分析四、存在问题和前景预测,背景,全球每年约150万新发胃癌病例，引起近50000人死亡血清肿瘤标志物，如CEA、CA19-9对早期大肠癌诊断的敏感性和特异性尚不足。内源性小RNA，即miRNA在血清中非常稳定，能区分肿瘤患者和非肿瘤患者的潜在能力，miRNA的表达水平和肿瘤的临床病理特征及肿瘤预后相关，能准确判断其组织来源、对组织学上难以诊断的低分化肿瘤进行分类。目前的研究通常是基于肿瘤组织的miRNA表达谱的研究，因此较难用于肿瘤的早期筛选。术前肿瘤组织的获得具有一定的创伤性，也限制了其在临床诊断中的应用。,目的,本研究应用实时定量PCR芯片结合定量PCR证，检测胃癌患者血清中特异相关miRNA，探讨候选miRNA作为胃癌诊断标志物的可行性。,立项研究内容,筛选胃癌相关microRNA建立外周血循环miRNA的检测方法检测并分析microRNA在胃癌诊断中的价值收集胃癌患者和正常对照者外周血标本,研究方案,(1) 招募研究对象，即临床诊首次断胃癌并未接受手术以及放化疗的患者和健康对照者，签署知情同意书，采集5ml外周血。(2) 采用Trizol-LS分离血浆/血清总RNA，加入RNA保护液于-80冰箱保存。(3) 文献挖掘及生物信息学数据库下载，统计分析筛选胃癌诊断相关microRNA。(4) 建立茎环逆转录荧光定量PCR方法检测血浆循环microRNA水平。,研究方案,(5) 逆转录条件和荧光定量PCR方法的优化。(6) 检测临床样本和健康对照组外周血循环microRNA水平(7) 临床资料和检测数据统计分析，确定胃癌诊断的microRNA组合模式，并提出诊断标准。,公共数据库下载,文献挖掘,胃癌相关miRNA,胃癌差异miRNA,备选miRNA,胃癌患者,健康对照,分离血浆/血清,总RNA提取,miRNA检测方法的建立和优化,循环miRNA水平与临床资料分析,胃癌早期诊断及预后的microRNA组合模式,技术路线,材料,Tri-Reagent BD试剂购自Sigma公司；miRNA定量PCR芯片检测购自Exiqon公司；miRNA定量PCR检测试剂盒购自Qiagen公司；DEPC水购自宝生物工程（大连）有限公司。,结果,采用含384条miRNA的定量PCR芯片检测3例-期的胃癌患者血清及3例健康对照血清miRNA的表达水平。结果显示（图1及表2），9条miRNA差异倍数大于2，且P值小于0.01，其中5条miRNA明显上调，4条明显下调。,胃癌患者特征血清miRNA的筛选,结果,进一步采用Qiagen公司的定量PCR检测试剂盒，分析100例胃癌患者血清标本及60例健康对照血清中候选miRNA的表达。如图2所示，筛选获得的9条miRNA均得到验证。,胃癌患者特征血清miRNA的验证,结果,聚类分析产生的系统树图可见，9个胃癌患者特征血清miRNA能够清晰地将胃癌患者与正常人分为两类。,胃癌患者特征血清miRNA的诊断效能评价,利用单一miRNA诊断胃癌的ROC曲线分析显示，9条均有较好的诊断效率。,进一步利用胃癌患者血清标本及健康对照血清的miRNA表达水平建立 logistic回归模型，采用ROC曲线分析9个胃癌患者特征血清miRNA的诊断效能。结果显示，检测胃癌样本的曲线下面积(AUC)达0.934 (95% CI 0.877-0.992)（P0.001）,技术创新,本项目采用定量PCR芯片结合定量PCR筛选、验证血清microRNA表达谱，获得9条胃癌特异相关的血清miRNAs。在分别分析单一miRNA诊断胃癌效率的基础上，综合9条miRNA，提出胃癌早期诊断的特异周血循环microRNA组合模式，为胃癌的诊断提供新的思路。,(四)总体评价结论,本研究达到主要技术指标要求，顺利完成各项立项研究内容。,取得技术、经济、社会效益分析,本研究达到主要技术指标要求，顺利完成各项立项研究内容。本研究筛选鉴定了9条胃癌特异血清microRNA，并评价其作为胃癌诊断的效应。本研究的结果发表学术论文2篇，目前正准备申请国家发明专利。,存在问题和前景预测,miRNA的鉴定为胃