乳铁蛋白在母乳中的含量测定及其生物学作用的初步研究

温州医学院 硕士学位论文乳铁蛋白在母乳中的含量测定及其生物学作用的初步研究姓名：单炯申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：何振娟20100501温州医学院硕上学位论文乳铁蛋白在母乳中的含量测定 及其生物学作用的初步研究目的本研究通过测定产妇母乳中乳铁蛋白（Lactofeirir LF)含量，分析母乳LF 水平及其影响因素；对分别应用含LF 配方奶喂养、不含LF配方奶喂养以及母乳喂 养的婴儿进行前瞻性对照研究，比较三组婴儿在生长发育、外周血常规以及生后6 个月内上呼吸道感染和腹泻的罹患情况。通过对含LF 配方奶喂养儿的血红蛋白及体 格生长变化的分析，研究含LF 配方奶的生物学作用。方法第一部分：收集产妇产后2-3天的初乳、6-7 天的过渡乳及 42天的成熟乳 标本共200份，其中初乳 85份，过渡乳56份，成熟乳59 份。利用酶联免疫吸附法 (ELISA)双抗体夹心法，对标本进行LF含量测定，并比较初乳组、过渡乳组和成 熟乳组LF含量；根据产妇的生产方式、年龄、所产婴儿的出生体重分组比较，分 析母乳LF含量的影响因素；第二 部分：将96 例正常足月新生儿分为含LF配方奶 喂养组，不含LF配方奶喂养组以及母乳喂养组。于出生当天、42 天、3月龄和6月 龄进行身高、体重和头围测量；于3月龄和6 月龄检测外周血 常规；对三组婴儿 在42天、3月龄、 6月龄的头围、身高、体重等生长发育指标进行比较分析；对 三组婴儿在3月龄、6月龄的血常规红细胞系各参数进行比较分析。 对三组婴儿在 生后6个月内的上呼吸道感染和腹泻罹患情况进行比较分析。结果第一部分：利用酶联免疫吸附法（ELISA)双抗体夹心法，测得200份母乳 标本的乳铁蛋白含量为：初乳组2.381.17g/l, 过渡乳组1.741.05 g/1、成熟乳 组1.32 土0.95 g/U三组差异有统计学意义（尸值0.05); 根据产妇的年龄分组，年龄0.05);线性回归分析显示产妇所产婴儿的出生体重与初乳、 过渡乳、成熟乳LF含量没有相关性（ /?值0.05);第二部分：（1)将96例正常足月 新生儿分为含LF配方奶喂养组，不含 LF配方奶喂养组以及母乳喂养组。方差分析 显示三组婴儿在其母亲年龄、胎龄、出生体重、出生头围以及身高之间的差异均无 统计学意义（PXJ.05);三组婴儿在42天和3 月龄的头围、身高、体重等生长发育 指标之间的差异均无统计学意义（P0.05)。含LF 配方奶喂养组在6 月龄的头围和 体重均显著高于不含LF配方奶喂养组 （P 0.05)。三组在6 月龄的身高的差异则均无显著性意义 （P0.05) ;三组婴1温州医学院硕士学位论文儿在3月龄的外周血红细胞计数、网织红细胞、血红蛋白浓度等参数之间的差异均 无统计学意义（P0.05)。含LF 配方奶喂养组在6 月龄的血红蛋白浓度明显高于母 乳喂养组（P0.05), According to the age of puerperas, there is no significant difference between age-below-28 group and age-above-28 group in colostrums, transitional milk and mature milk LF level(P0.05)，Linear regression analysis shows that there is no correlation between the birth weight of the newborn with the LF level in colostrums, transitional milk and mature milk(P0.05).Part2:(l) We divided 96 normal full-term infants into three groups. They are LF-formula-fed group, non-LF formula-fed group and breast-feeding group. And analysis of variance shows that there is no statistically significant difference in the age of their mothers, gestational age, birth weight, birth head circumference and body length (P0.05).(2)There is no statistically significant difference in the head circumference, body length ,body weight and other growth development index in their 42 days and 3 months among three groups (p0.05).When these infants are 6 months old, Their head circumference and body weight of LF-formula-fed group is significant higher than the non-LF formula-fed group (P0.05) .There is no significant difference in the body length of the three groups in 6 months (P0.05).(3)There is no statistically significant difference in Peripheral blood RBC, Ret, Hb and other parameter among three groups in 3 months(P0.05).When they are 6 month，Hb of LF-formula-fed group is significant higher than the breast-feeding group(P0.05), and Hct, MCV and Ret is significant higher than the non-LF group and breast-feeding group(P0.05). (4)There is no significant difference in the incident of upper respiratory tract infection and diarrhea among three groups when they are 6 months.Conclusion: (l)The downward trend of LF level in milk sample of colostrum, transitional milk, mature milk match with foreign reports. But the value of the content level is obviously lower than foreign standards. Especially the colostrum is significantly lower than foreign reported. (2)This research shows there is no relativity between the method of birth given, age of puerpera , weight of infants and LF level in breast milk.(3)LF formula-fed could help to prevent infants from anemia and promote infants ability of hematopoiesis. It has a similar effect with breast fed in promoting infants growth. (4) Recommend to add LF to formula milk powder.Key Word Lactoferrin Breast milk Influencing factor Biology effect4温州医学院硕士学位论文刖自乳铁蛋白（Lactoferrin ，LF) 最早是在1939 年被Sorensen 等人从牛乳中发现， 因其结晶呈红色，也被称为“红蛋白”。1960年Groves首先从牛乳中分离获得牛乳 LF (bovine Lactoferrin, BLF)，1961 年 Blanc 和 Isliker 从人乳中分离获得人乳 LF (human Lactoferrin, HLF). 1984年 Metz-Boutigue 确认了 LF 的氨基酸序列。 1987年Anderson明确了 HLF的三维结构。 1997年Moore明确了 BLF的三维结构 1。LF是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达和分 泌，少量来自多形核白细胞，在泪液、唾液、精液、滑膜液中含量甚微。大多数哺 乳动物都能产生LF, 但不同乳源的LF 含量存在较为显著的差异。据国外文献报道， 人乳LF含量为2-4g/L,在初乳中更高，可达6-8 g/L。而牛乳LF含量较低，仅为0.02 -0.35 g/L,在牛的初乳中为 1-5 g/ll2LF是一种分子量为80KD的糖蛋白,其多肽链由703个氣基酸组成。HLF 和BLF 氨基酸顺序的同源性达69% 3。LF的二级结构以ct 螺旋和P 折叠为主，两者沿蛋白 质的氨基酸顺序交替排列，而且a螺旋大大多于p折叠。LF 多肽链上结合有 2条糖 链，含量约为 7%左右， 糖的组成有半乳糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺以及岩藻糖等。 LF的立体结构主要呈“二枚银杏叶型 ，分别在分子的N端和C端形成2个环状结 构(N-叶和C-叶 )，每叶在内部裂缝处有一个铁结合位点，每个位点可结合一个Fe 3* 和一个HCCV或C0 32,所以每个LF分子可结合两分子Fe 3+和两分子的HC(V 或C0, 4。 F，结合到LF后引起后者的构象发生变化，即铁进入敞开的裂隙内部后，两结构域 闭合，使LF的分子结构更趋紧凑 5。LF具有可逆性的铁结合特性，铁结合的 LF可随pH的降低而释放铁离子。铁结 合率在95%以上时为铁饱和型 （ holo-LF)，在5%以下为铁缺失型（apo-LF)。铁 结合率和pH值影响LF的稳定性。实验表明， LF在酸性条件下的热稳定性很高。体 外实验表明，LF依次经过胃蛋白酶和胰蛋白酶的环境不会被消化并保持生物学活性， 因而能够耐受胃肠消化作用，并能够在肠内发挥相应的作用 6#大量研究表明，LF是一种多功能的蛋白。它的功能主要 包括：调解铁的平衡、 促进铁的吸收 7;抗细菌、病毒、真菌、寄生虫等微生物感染 89111;调节免疫 阻断氧自由基；避免刺激肠胃；参与骨髓生成调控；刺激双歧杆菌生长，调解肠道 菌群；抑制肿瘤生长和转移 14等。鉴于 LF具有重要的生物学活性，其在婴儿喂养中的含量要求十分必要。因此，5温州医学院硕士学位论文国外学者纷纷测定母乳LF含量，并致力于 LF开发和应用的研究。目前含有 LF的婴 儿配方奶已在日本及其他发达国家上市。而国内对LF 的含量测定均停留在十至二十 年前的文献报道，测量方法和测定值不尽相同，且国内上市的婴儿配方奶中LF含量 甚微。母乳质量直接影响新生儿的生长发育，世界卫生组织WHO 已将模拟母乳成分及 含量研制婴儿配方奶作为重点研究项目之一。换言之，模拟母乳中各成分含量，改 善配方奶质量，使其更接近生物学状态是WHO的要求，也是乳品业追求的方向。然 而，就目前而言，LF含量在中国人乳汁中的含量如何尚无确切资料，国内权威资料 所载的母乳成分及含量，特别是母乳中抗菌成分的含量均来自国外参考资料。因此， 调查研究中国人群母乳成分的状况，探索研制适合中国婴儿生长的配方奶粉具有十 分重要意义。本研究希望通过测定母乳LF 含量以及探讨含LF配方奶喂养婴儿在血 红蛋白和体格生长方面的变化，为研制适合我国婴儿的配方奶及合理添加LF提供科 学依据，更好指导我国婴儿喂养，也为国内深入开展此方面研究提供科学、准确的 测定方法和数据。6温州医学院硕士学位论文第一部分乳铁蛋白在母乳中的含量测定引言LF主要存在于哺乳动物的乳汁中，在初乳中的含量最高。鉴于LF 的多种生理 功能，其对于婴幼儿而言不可或缺。据WHO报道：在发展中国家， 20-25%的婴幼 儿在发育过程中会受到四个主要风险因素的影响，缺铁性贫血是其中之一。一项关 于我国9118名7个月至7岁儿童铁缺乏症流行病学调査研究显示 : 7至12个月婴儿 的铁减少患病率为44.7%、缺铁性贫血患病率为20.5%,较幼儿组和学龄前组儿童均 高，提示婴儿是铁缺乏症的高发人群 15。而LF具有结合并转运铁的能力，能增强铁 的实际吸收性和生物利用率，可降低有效铁使用量，减少铁对机体的负面影响，并 对肠道中的铁离子具有增溶作用“ 6。因此，LF有助于预防婴儿缺铁性贫血的发生。 其次，由于新生儿的免疫系统约在1岁左右才发展成熟，他们对抗感染的能力比儿 童和成人弱；婴幼儿消化功能较弱，容易发生肠道疾病，使营养摄入受到影响，进 而影响生长发育水平。所以，LF 可以帮助婴幼儿抵抗大肠杆菌等微生物，降低病毒 引起的腹泻等婴儿常见疾病，构筑起人生的第一道防线。母乳作为一种天然、合理 的婴儿营养品，母乳喂养儿患病率明显低于人工喂养儿，可见其包括LF在内的生物 活性物质的组成及含量是最合理的。因此，各国为制定最适合本国婴儿使用的配方 奶， 都通过测定母乳中包括LF 在内的各种成分的含量，为婴儿喂养提供最合理的依 据。Montague P等人对法国哺乳期产妇的360例母乳样本检测后发现，母乳LF含量 分别为：初乳5.8g/L, 过渡乳3.1 g/L, 42天成熟乳2.2g/ Ll7。印度Dawarkads AM 等人测定10例足月儿母亲的母乳LF 含量发现：初乳、过渡乳、成熟乳中LF含量分 别为6.7 0.7g/L, 3.7 0.1g/L 和2.6 0.4g/L18。在我国，关于母乳 LF 含量 测定的报道较少，且测定方法和测定值都不尽相同。莫秀芬等人于1985年，用人LF 免疫单扩散法，测定初乳、成熟乳中LF 含量分别为6140. 1 1.339. lug/mL、2309.5 194.2 ug/mL,接近于国外水平 19。而98年首都医科大学的文献报道：用化学发光 法测定足月儿母亲的初乳LF含量为 858.479.8ng/L,成熟乳LF含量为222.9土 47. lng/L,仅为国外数据的几千分之一 20。本研究利用酶联免疫吸附法（ELISA )双 抗体夹心法测定母乳LF含量。7温州医学院硕士学位论文材料与方法1. 研究对象2008年3月至11月间，共收集上海、广州、长春等地区的产妇母乳标本200 份。 其中，初乳85份、过渡乳 56份、成熟乳 59份。同时，记录提供标本的产妇的姓名、 年龄、生产方式，以及所产婴儿的胎龄、性别、出生体重、Apgar评分等一般资料， 所有提供标本的产妇均知情同意。其中，初乳、过渡乳和成熟乳标本均收齐者共36 名产妇。将该36 名产妇作为LF含量影响因素的研究对象。产妇均无妊娠和分娩并 发症，平均年龄27.443.26 岁。所产婴儿均为足月儿，无窒息史，平均出生体重 3484.72437.98g,2. 实验方法2.1仪器和试剂：2.1.1实验仪器：(l)HyCult biotechnology b.v.生产的 Human Lactofemn ELISA kit (Cat. #:HK329 Lot. #:4722K18 Size： 2*96 assays)Thermo MULTISKAN ASCENT 酶标仪 37C孵育箱 洗板机 离心机微量可调量程移液器 量筒2.1.2实验试剂：2.1.2.1试剂盒配备试剂：洗脱液原液20 ml 稀释缓冲液原液 20ml 标准品*1瓶： 200ng/ral 酶标记物*2 瓶 过氧化物酶*1 瓶 (6)TMB 底物22 ml 终止液22ml 2.1.2.2蒸馏水 2.2实验环境：8温州医学院硕丄-学位论文室温 18-25 C。2.3实验步骤：2.3.1标本采集： 收集产妇产后 2-3天的初乳、6-7 天的过渡乳及42 天的成熟 乳3 ml,均在上午采集，均为前段乳，用吸奶器吸取奶汁，放入无菌试管，置一80 -C冰箱保存待测。2.3.2标本处理： 待测标本经10000 rpm离心10 分钟，去脂，取上清液。2.3. 3标本稀释：每份标本取5W,用蒸馏水按1: 100000比例稀释，并编号。2