安络小皮伞液体深层发酵条件优化的研究

吉林大学远程教育本 科 生 毕 业 论 文 （ 设 计 ）中文题目 安络小皮伞液体深层发酵条件优化的研究学 生 姓 路 园 园 专 业 药 学 层 次 年 级 _1409 学 号 201409960544 指 导 教 师 张 新 茹 职 称 讲 师 _学 习 中 心 高 邑 奥 鹏 学 习 中 心 成 绩 2016 年 9 月 18 日摘要安络小皮伞菌是我国传统的药用真菌，不仅在药用方面有很好的功效，在食用和保健方面有很高的价值，因此，对小皮伞菌液体深层发酵研究具有重要的意义和价值。 本实验通过单因素实验和正交试验对小皮伞菌发酵条件进行优化。主要研究内容及结果如下：以提高安络小皮伞菌生物量为目的，对小皮伞菌培养基及其发酵条件进行系统的优化。对 C 源和 N 源种类进行筛选，在此基础上对其浓度进行优化，通过正交试验对小皮伞菌培养基成分进行优化，最终确立了最优培养基为玉米粉：3 %、麸皮： 3 %、Mg SO4：0.1 %、KH 2PO4：0.3 %、VB 1：10 mg、水：1000 m L；通过对小皮伞菌液体发酵时间、温度、转速及其培养基的初始 p H、接种量、装液量进行筛选，确立了最适发酵条件为:发酵时间：6 d、温度：25 、转速：150 r/min、初始 p H：5、接种量：9 %、装液量：90 m L。 关键词：安络小皮伞菌，发酵条件，培养基，培养条件目录摘要 .I ABSTRACT . III1 前言 . 11.1 安络小皮伞的概述介绍 . 11.1.1 安络小皮伞简介 . 11.1.2 安络小皮伞的形态特征 . 21.1.3 安络小皮伞的生态习性5 . 31.1.4 安络小皮的主要成分 . 41.2 安络小皮伞液体深层发酵技术 . 41.3 安络小皮伞的药用价值 . 51.3.1 抗氧化作用 . 51.3.2 增强免疫的作用 . 51.3.3 抗肿瘤作用 . 51.3.4 镇痛作用 . 61.4 立题的依据及意义 . 71.5 本研究的主要内容 . 81.5.1 安络小皮伞发酵条件的优化 . 82 安络小皮伞液体发酵条件的优化 . 92.1 材料和试剂 . 92.1.1 实验菌种 . 92.1.2 实验试剂 . 92.1.3 仪器设备 . 92.1.4 培养基 . 102.2 实验方法 . 102.2.1 菌种复壮 . 102.2.2 菌种培养 . 102.2.3 生物量的检测 . 102.2.4 培养基的优化 . 112.2.5 培养条件的优化 . 122.3 结果与分析 . 132.3.1 培养基优化单因素实验结果 . 132.3.2 培养基优化正交试验结果 . 142.3.3 发酵条件的优化结果 . 162.4 讨论 . 203 结论与展望. 393.1 结论 . 39 3.2 展望. 40参考文献. 43致谢 . 471 前言1.1 安络小皮伞的概述介绍1.1.1 安络小皮伞简介安络小皮伞学名为 Marasmius androsaceus 是一种生长于密林中的真菌，因为其有黑色，密生的针状菌索，所以又称其为鬼毛针，茶褐小皮伞等，属于担子菌纲、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(Thicho Lomataceae)、小皮伞属(Marasmius)1，如图 1-1。安络小皮伞始载于新华本草纲要 ，性温，微苦，归肝经。具有消炎、止痛的功能。主要分布于我国吉林、辽宁、湖南、湖北、广东等省 2。我国民间早有用野生安络小皮伞的根状菌索来治疗骨折疼痛、跌打损伤等。现在临床和市场上用小皮伞菌制成的药物有很多，主要的有“安络痛” （其制剂分为胶囊和注射液两种） 、 “安络痛酊” 、 “安络解痛片”等 3-4。小皮伞菌含有水溶性多糖等成分，具有一定的抗氧化作用，其内含有的皮伞碱具有镇痛镇静作用，此外，安络小皮伞中含有多种氨基酸，具有很高的营养价值和保健价值，经研究其主要表现在能促进神经组织和纤维结缔组织的炎症消失，改善局部的血流循环和组织营养状况，恢复神经功能 5。随着安络小皮伞菌液体发酵技术的应用和对安络小皮伞菌营养价值和药理作用的研究，安络小皮伞菌的大量生产和深入探究安络小皮伞菌所具有的更多药理特性，使其在药品制剂、功能食品、保健品等方面得到广泛的开发与应用，具有良好的市场和经济价值。图 1-1 野生安络小皮伞菌1.1.2 安络小皮伞的形态特征 安络小皮伞子实体小群生或散生，长在基物上或根状菌索上。其菌盖呈半球状，直径约为 0.5cm2cm，菌盖的上面有沟条，其中间部位呈脐状。安络小皮伞的膜质中间厚边缘薄，坚韧而光滑，但是比较干燥，它的颜色为红褐色或茶褐色，从中间到两边颜色逐渐变浅。菌褶比较稀疏，有长有短，颜色为白色，直生至离生。菌柄中生 3-5cm，长在基物上的柄长，长在菌索上的柄短，粗 1 毫米或稍粗，细针状，黑褐色或稍浅，平滑，弯曲，中空软骨质。菌索特别发达，脆骨质，呈黑褐色至黑色，顶部色浅为淡黄色，光滑无毛，直径0.5mm1mm，如果环境和温度比较适合，菌索可达 150cm 以上，形状非常像细铁丝或马鬃毛，有的分支有的不分枝。孢子无色无臭味，呈长方椭圆形，光滑，6m9m3m4.5 m 6。（1）菌丝安络小皮伞的菌丝为白色，呈丝状，显微镜下观察为无色，有内含物，有横隔，有分枝，宽 2.5-3m，斜面培养比深层培养的菌丝可以观察到更多锁状联合。在斜面培养和平板培养时，菌丝容易出现老化现象，菌苔从白色变成棕褐色，最后变成黑色。（2）菌球摇瓶液体发酵培养时，接种后，菌丝萌发伸长和分枝，然后纵横交错，相互缠绕而形成菌球。刚开始形成的菌球，菌丝交织疏松， “毛刺”比较长，随着培养时间的增加，菌丝和菌球缠绕的越来越紧密， “毛刺”变短，形成球形或者近球形，直径大多在 3-5mm，也有小至 1mm 大至 14mm 的，菌球的大小受接种量、培养基成分和摇床转速影响很大，接种量大菌球大且少，液体培养基中沉淀或粉状物质太多，菌球的数量会多小，摇床转速越快，菌球多而且小，若转速太快则形成不定型的菌丝体，不能形成菌球。菌球有空心和实心两种，表明具有短绒毛或放射状的“毛刺” 7。1.1.3 安络小皮伞的生态习性小皮伞菌生长于深山密林，阴凉潮湿，近水，酸性土上面的枯枝、腐木、落叶、竹林枯木或竹枝上，产生根状菌索的时间为每年的 5 月10 月（林下温度约为 1528） ，产生子实体以 6 月8 月较多，温度以 2226为佳。子实体和跟状菌索的形成和生长发育皆需要很高的湿度，特别是空气湿度需要饱和或接近饱和，往往是在下雨时或刚下雨后形成，并在此条件下继续生长发育。空气湿度太低，子实体和根状菌索不能形成，已形成的也会停止生长，当空气湿度饱和时，又会恢复生长或菌索会产生分枝。如果长期处在低湿度空气条件下，小皮伞菌生长受阻，容易污染霉菌。空气条件差的情况下，子实体和菌索也易被杂菌污染。在完全黑暗的地方，菌丝体可以生长，但不能形成子实体和菌索。当菌索和子实体形成以后，长期黑暗，其生长也会受到抑制，断续的光照，生长不受影响。子实体形成适宜的光照强度为 10-20 万 lx 即可以满足。 小皮伞菌是一种腐生菌，但其根状菌索在生长过程中如果遇到合适的活体植物，便会在植物上长出白色的菌丝，生长一段时间后会变成褐色，菌索会攀援植物的茎、枝或叶向上生长。若缠绕活植物的菌索较多，会引起植物的病变或死亡。 小皮伞菌生长时如果某种原因致使其根状菌索断裂，它可以在断裂处从新长出白色菌丝一段时间后，菌丝由白色变成褐色，长出新的菌索，继续生长。菌索与菌索相遇可以彼此相连长出菌丝。采收期 6-10 月为宜，由于皮伞菌易吸湿发霉，所以样品采集后烘干保存备用。 1.1.4 安络小皮的主要成分安络小皮伞中含有多种成分 8，有多糖、氨基酸、腺苷、甘露醇、胆甾醇醋酸酯、伴半萜内酯、有机酸、异香豆素、三十碳酸、2,3,5,6-四氯-1,4- 二甲氧基苯、B 谷甾醇棕榈酸酯、 5,8-过氧麦角甾醇、B 谷甾醇、麦角甾醇、总生物碱等。有镇痛作用的成分为三十碳酸、2,3,5,6- 四氯-1,4- 二甲氧基苯、伴半萜内酯和麦角甾醇。 1.2 安络小皮伞液体深层发酵技术液体深层发酵技术属于现代生物技术之一，该项技术的权威是美国弗吉尼亚大学生物工程专家 Elmer L、Gaden Jr，其在 20 世纪 40 年代设计出生物反应器用来培养微生物系统。液体发酵技术是指在生化反应器中，模拟菌株在自然界中的生活环境，将其生长所必需的糖类、氮元素化合物、无机盐和微量元素等营养物质溶解在水中配制成菌株培养所需的培养基，灭菌后进行接种，控制适宜的温度、转速、通氧等外界条件对菌进行大量培养繁殖的过程。第一次应用该项技术的是美国的 H. Humfeld，对蘑菇进行液体发酵并得到蘑菇菌丝体。 J. Szuecs 首次将发酵罐用于液体发酵技术，1958 年培养出羊肚菌。国内对液体深层发酵较早的报道是 1960 年上海植物生理研究所陈美聿等人对香菇的液体发酵培养。林忠平等人在 1973 年对灵芝进行深层发酵的研究。80 年代后，随着此项技术的发展，国内外对液体深层发酵技术纷纷展开了研究与探讨 9。安络小皮伞是我国传统的药用真菌，其液体深层发酵技术发展的比较早，已有成型的培养方案，但是应用于大规模生产的研究比较少。最早成功大规模生产安络小皮伞菌的研究是广州微生物所与广州第一制药厂联合研制安络痛。发酵培养基的配方为：葡萄糖 3 %，玉米浆 0.5 %，酵母膏 0.2 %，Mg SO4 0.05 %，KH 2PO4 0.1 %，消沫油 0.1 %，p H 6.5。培养条件为：接种量 1.5 %-2 %，温度 24-26 。通气培养时间 4-5 d，通气量每分钟 1：1-1 ：1.5(v/v)；罐压0.3-0.5 kg/cm2。制作安络痛，此条件下培养得到的安络小皮伞可满足需求。李雪梅在安络小皮伞菌液体发酵过程中还原糖与菌丝体干重、p H 值及产量的关系的研究中得到了在发酵过程中，随着总糖的消耗，还原糖的含量逐渐降低，且与 p H 值的变化呈正相关，与菌丝体干重及产量的增加呈负相关，为安络小皮伞发酵的生产提供了重要的理论依据 10。1.3 安络小皮伞的药用价值1.3.1 抗氧化作用王曦 11等人用醇沉法对安络小皮伞菌丝体粗多糖进行分级沉淀，其分级产物对OH 和O 2-都有很强的清除作用。分级产物对羟基自由基的清除能力随着乙醇加入倍数的增大而增强，当加入 4 倍体积乙醇时，对其清除率可达到 49.72 %此时产物浓度为 0.4 mg/m L，说明安络小皮伞多糖对OH 有很强的清除作用。不同乙醇体积的分级产物对O 2-清除能力不同，当乙醇等量与溶液体积时，得到产物对O 2-的清除率最大可达 42.22 %。梁启