人类细胞质、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用ppt课件.ppt

1、人类细胞质、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用,1,分离提纯RNA的目的,分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物,2,RNA提取的原理,在哺乳动物中，rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。 rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外）在3端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)

2、。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。,3,RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。,4,1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高

3、的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,RNA提取的方法,5,Trizol法,Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。,6,Trizol法,Tri

4、zol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。,7,Trizol法,Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人

5、，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。,8,RNA提取的一般步骤,9,1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行 可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织 加入-ME可以抑制RNA酶活性,2、分离RNA 一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。,3、沉淀RNA 一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。,10,4、洗涤RNA 使用70乙醇洗涤，有时

6、，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。,5、融解RNA 一般使用TE(缓冲液）。,6、保存RNA 应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此。,11,琼脂糖凝胶电泳的原理,琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支 持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用核 酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳度 有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的种 方法。,12,琼脂糖凝胶电泳的应用,分离不同片段大小和不同构象的DNA、RNA

7、分子 鉴定DNA的片段，如PCR产物的鉴定 纯化DNA分子,13,2020/10/20,琼脂糖凝胶电泳,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,14,2020/10/20,人类细胞质RNA提取,完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解,可能的原因是RNase。,15,RNA电泳结果,rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也

8、不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。,16,RT-PCR,RT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。是一快速、简便、敏感性极高的检测RNA的方法。,17,RT-PCR的原理,提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,18,RT-PCR的应用,分析基因的转录产物 获取目的基因 合成cDNA探针 构建R

9、NA高效转录系统,19,2020/10/20,RT-PCR的步骤,提取原理 、方法,逆转录酶、引物,提 取 总RNA,合成cDNA,原理体系 引物选择,PCR,电泳原理 电泳步骤,电 泳,提 取 总RNA,合成cDNA,PCR,电 泳,20,21,逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。,逆转录反应 (RT),mRNA,3-TTTTTT(18)-5,68-70oC, annealing,3-TTTTTT(18)-5,37-42oC, RTase,mRNA,mRN

10、A,cDNA,10min,1-2h,RT,22,RT-PCR的逆转录酶,逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 常用的逆转录酶有两种：鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV)反转录酶 莫罗尼鼠类白血病病毒（MMLV)反转录酶,23,合成cDNA引物的选择,1随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止

11、的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。,24,合成cDNA引物的选择,2Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。,25,合成cDNA引物的选择,3异性引物：最特异

12、的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,26,PCR,PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。 以上三步为一个循