方 血红蛋白的提取和分离.ppt.ppt

1、血红蛋白的结构示意,根据课题背景回答下列问题：,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了_和时代。,人类基因组：,蛋白质组：_ 主要是对_,后基因组,蛋白质组,指DNA分子所携带的全部遗传信息。,生物个体表达的蛋白质分子的总和,蛋白质功能的研究,血红蛋白质的主要功能是：_。,负责血液中O2和CO2的运输,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的的方法，分离具有不同的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种_，如_、和、3、溶解度、4、吸附的性质和等等，可以用来分离不同蛋白质。,特性的差异,1、分子的形状,大小,物理或化学,物理或化学

2、性质,2、所带电荷的性质和多少,5、对其他分子的亲和力,思考3 高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性,思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有_，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无_，结构简单，_含量丰富便于提取血红蛋白。,变性,空间结构,细胞核,细胞核,血红蛋白,一、基础知识：, 凝胶色谱法（也叫分配色谱法）：,2、凝胶：,一些微小多孔的球体-分子筛（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）,根据被，利用具有网状结构的_（分子筛）的作用，来进行分离。,1、概念：,分离物质的蛋白质相

3、对分子质量的大小,凝胶,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_，移动速度_，而_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度_，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,也称：洗脱瓶,1、概念：由溶解于水中，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。, 缓冲溶液：,2、缓冲作用： 在一定范围内，能够抵制对溶液的影响，维持PH基本不变。,外界的酸、碱或稍加稀释,PH值,12种缓冲剂,调节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液。,使用比例,在不同PH范围内,3、缓冲溶液的正确

4、配制和PH的准确测定的重要性,生物体进行的各种生物化学反应都是在一定的PH下进行的，为了能够在实验条件下的过程，就必须保持的基本一致。,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,准确模拟生物体内,体外溶液的PH与体内环境中,电泳：,1、概念：_ _,思考：在血红蛋白提取和分离的整个实验中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是_，目的是利用缓冲液模拟_，保证血红蛋白的_。）,磷酸缓冲液,细胞内的PH环境,正常结构和功能,只有血红蛋白_才能保证的材料的科学研究；材料为_色便于_。,指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,仍具有活性,观察

5、,红,2、原理：许多重要的生物大分子，如 _等都具有_ 在 _下，这些基团会带上_ 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其_移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_以及分子本身的_、_的不同使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状的,迁移速度,一定的PH,电泳方法分类：,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介 质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如 大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼 脂糖凝胶进行电泳分离。,聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE),聚丙稀酰胺凝胶电泳：,测定

6、_通常用： （SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,聚丙稀酰胺凝胶：,是由单体丙烯酰胺和交联剂（N,N-亚甲基双丙烯酰胺）在引发剂(过硫酸铵）和催化剂（四甲基己二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,电泳方法分类：,SDS是一种蛋白质变性剂十二烷基硫酸钠,SDS的作用是什么呢？,为了消除_对迁移率的影响可以在凝胶中加入_，它能使_。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是_。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量_蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的_，使电泳迁移率完全取决于_。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶

7、中的迁移率取决于它_以及_等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,所带静电荷的多少,分子的大小,静电荷,蛋白质发生完全变性,大大超过了,电荷差别,二 实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐 磷脂 葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白 （ ）,两个a肽链,两个一肽链,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,每个肽链环绕_，此基团可携带_。血红蛋白因含有_而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,一个亚铁血红素基团,一分子氧或一分子二氧化碳,血红素,(1)红细胞的洗涤,

8、血液 100mL,搅拌10min,重复洗涤3次，直至表明：,红细胞已洗涤干净,上清液没有黄色,低速短时间 离心2 min,吸出血浆,5倍体积生理盐水,洗涤目的：去除_ 洗涤方法：_离心（洗涤速度过高和时间过长会使_等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的_，将下层_的红细胞液体倒入_再加入用_的_质量分数为_溶液洗涤。,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,烧杯,白细胞和淋巴细胞,五倍体积,生理盐水,0.9的氯化钠,洗涤次数过少：,无法除去血浆蛋白,(2)血红蛋白的释放,加_到_体积，再加40体积的_ ，置于_上充分搅拌10分钟, 细胞破裂释放出血红蛋白.,原血液,甲苯,磁

9、力搅拌器,蒸馏水,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌10分钟的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？,(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:,脂溶性沉淀层,分离过程,红细胞 混合液,离心管,烧杯,有机溶剂甲苯,高速离心 10min,滤纸 过滤,血红 蛋白,第1层（最上层）： （ ）甲苯层,第2层（中上层）： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体,第3层（中下层）： （ ）的水溶液层 （ ）的液体,第4层（最下层）：

10、其它杂质（ ）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,用湿滤纸过滤，除去_，于中静置片刻后，分出下层的红色透明液体,即为。,脂溶性沉淀层,血红蛋白,分液漏斗,取ml的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的中，pH为，透析12小时，目的是或用于更换样品中的。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。,除去样品中小分子量的杂质,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,缓冲液,(4)透析,1,血红蛋白的粗分离,2.凝胶色谱制作,1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米（不超过1m），内径1.6厘米（不超过2cm）的玻璃管，两端需用砂纸磨平,底塞的制作：打

11、孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ ），在0.5ml的（ ）头部切下（ ）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。,凹穴,移液管,5cm,纯化方法,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则，还会导致，蛋白质分离不彻底。,c.剪小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集的收集器内,橡皮塞的凹面,100目,上部,出口部位,尼龙管,打开与关闭,色谱流出液,难以铺实尼龙网,液体残留,尼

12、龙网,安装其他附属结构。,顶塞的制作：,插入安装了玻璃管的橡皮塞,组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。,安装了玻璃管,2）凝胶色谱柱填料的处理,（1）凝胶的选择：（ ） （G-75）：“G”表示凝胶的、 及。 75表示凝胶的，即每克凝胶 膨胀时吸水。,（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（也可用洗脱缓冲液）中充分溶胀后，配成。,蒸馏水,凝胶悬浮液,交联葡聚糖凝胶,交联程度,膨胀程度,分离范围,得水值,7.5克,固定：将色谱柱处置固定在支架上,装填： 将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,（3）凝胶色谱柱的装填方法,凝胶悬浮液,色谱

13、柱,注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？,2、凝胶色谱柱的装填,洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。,洗涤平衡,

14、注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,50cm,3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,50cm,加透析样品,调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ） 样品渗入凝胶床：（ ） 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集,注意正确的加样操作： 不要触及破坏凝胶面 贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移

15、动,吸管,透析液,顶端,样品完全进凝胶层,5ml,红色的蛋白质,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。,思考,样品的粗分离,纯化,纯度鉴定,你能描述血红蛋白的提取和分离的 完整过程吗？P70 第4题,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作

16、。,思考,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的纯度鉴定。,纯化,血红核蛋白 纯度鉴定,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的

17、日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,回忆蛋白质的有关知识,(一）蛋白质,占细胞干重的50以上，

18、细胞中含量最多的有机物,2、组成元素,C、H、O、N,一、基础知识,1、含量,3、相对分子质量,高分子化合物,4、基本组成单位,氨基酸,5、氨基酸通式,6、氨基酸连接方式,脱水缩合,8、分子结构,7、肽键,10、生理功能,细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者,氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别,9、蛋白质结构的多样性,氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个,若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n - m个肽键,脱去个n - m个水分子，至有氨基和 羧基各m个,11、相关计算,（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：_、_、_和_。 （2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。 加入柠檬酸钠的目的_。 以上所述的过程即是样品处理，它包括_、 _、收集血红蛋白溶液。 （3）收集的血红蛋白溶