细菌DNA提取方法

1、细菌dna提取方案细菌dna提取方案：革兰氏阴性菌，如e.coli，一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法主要用于pcr反应1、接种单菌落于lb或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养1824小时。2、刮取12接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。3、12000转/分钟 离心10分钟，取上清，20摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有rna、等杂质。但是作为一般目的的pcr反应模板已经足够了。有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板pcr可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议

2、每月重新制作一次。二、ctab/nacl 法1、接种一单菌落于5mllb中,30培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%lb中,37、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。4、加入10mlte离心洗涤后,用10mlte溶解菌体,混匀,-20保存备用。5、取3.5ml菌悬液,加入184l10%sds,混匀,加入37l10mg/ml蛋白酶k,混匀,37温育1小时6、加入740l5mol/lnacl,再加入512lctab/nacl,混匀,65温育10分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。8、上清中加入等体

3、积的酚氯仿异戊醇(25241),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集dna沉淀,用70%乙醇离心洗涤dna沉淀。10、用1mlte溶解dna,加入终浓度为20g/mlrnasea,4保存。ctab/nacl法提取的dna纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20g/ml rnasea加在第5步温育的时候，这样最后没有rnasea污染。每一步操作细致一些，得到的dna可用于southern blot。编者建议：长时间保存dna可放于-20，但要尽量减少反复冻融，否则影响dna质量。三、盐析法1、1.

4、5ml对数期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul裂解液（同ctab/nacl法），37c,1hr4、66ul 5m nacl,混匀充分，12000rpm 10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇9、-20c，20min，14000rpm， 15min10、400ul 70%冷乙醇洗涤11、干燥，100ul 20ug/ml rnasea，37c，30min12、2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤13、干燥，溶于100ul te介于

5、方法一和方法二之间，ctab虽然取出糖分效果较好，但ctab本身也是有毒的，所以此方法放弃了ctab。革兰氏阳性菌，由于壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取ctab/nacl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。实验注意：提组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！细菌基因组dna的提取方法综述，提供了5种方法。 1 快速微量提取法a.取1.5ml菌体培养物于一灭菌ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。b.加入400ul裂解液（40mmtris-醋酸，2

6、0mm醋酸钠,1mmedta,1%sds,ph7.8）混匀,置于37oc水浴1hr。c.然后加入200ul5mol/l的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。d.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。e.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3m ,ph8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulte溶液中，置4保存备用。2 蛋白酶/sds法制备先用10ml含适当抗生素的gbm过夜培养delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用washing te（50mmol/ltr

7、is-hcl ph8.0,10mmol/ledta ph8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1te缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/l的蛋白酶、0.5ml 10% sds，轻轻混匀后50放置3h5h，接着用等体积的tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀dna，用自动移液器吸管头将絮状dna沉淀块吸附到ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1te或ddh2o中。31) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml ep管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉

8、淀重新悬浮于1ml te（ph8.0）中（用ddh2o也行)。3) 菌体裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/lnacl50l，10%sds 110l，20mg/ml的蛋白酶k 3l，50作用3h或37过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml ep管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7

9、) 抽（凉）干后，溶于50l ddh2o中，取2-5l电泳。作pcr模板用。4. dna extraction procedure - general1) grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mm tris (ph 8.0), 50 mm edta.3) freeze cell suspension at -20c4) add 0.5 ml 250 mm tris (ph 8.0), 10 mg/ml lysozyme to

10、 frozen suspension, and let thaw at room temperature. when thawed, place on ice for 45 min.5) add 1 ml 0.5% sds, 50 mm tris (ph 7.5), 0.4 m edta, 1 mg/ml proteinase k. place in 50c water bath for 60 min.6) extract with 6 ml tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000x g for 15 min. transfer to

11、p layer to new tube (avoid interface). re-do this step if necessary.7) add 0.1 vol 3m na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).spool out dna and transfer to 5 ml 50 mm tris (ph 7.5), 1 mm edta, 200 g/ml rnase. dissolve overnight by rocking at 4c.8) extract with equal vo

12、lume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000x g for 5 min. transfer top layer to a new tube.9) add 0.1 vol 3m na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) spool out dna and dissolve in 2 ml 50 mm tris (ph 7.5), 1 mm edta.11) check purity of dna by electro

13、phoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。2) 加9.5ml te悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% sds, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 k, 混匀, 37保温1小时。3) 加1.5ml 5mol/l nacl, 混匀。4) 加1.5ml ctab/nacl溶液, 混匀, 65保温20分钟。5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干

14、净管中。7) 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀dna。8) 用玻棒捞出dna沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml te, -20保存。如dna沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使dna沉淀。9) 如要除去其中的rna, 可以按本章第三节中操作步骤处理。注：1)ctab/nacl溶液：4.1g nacl溶解于80ml h2o,缓慢加入10g ctab,加水至100ml。2)氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，te，10% sds，蛋白酶 k (20mg/ml或粉剂)，5mol/l nacl。本方法通过sds裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，ctab去除多糖成分一：仪器：同方法一 二：试剂：te、tae缓冲液；10%sds；nacl；20mg/ml蛋白酶；ctab/nacl溶液(10% ctab，0.7m nacl 4.1gnacl 溶于80ml水中，缓慢加入10gctab，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；及100%乙醇三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500l te缓冲液中混匀 30l 10%sds,3l蛋白酶，混