微生物检验与临床.ppt

1、微生物检验与临床,烟台海港医院 王功军,主要内容,1.微生物检验的方法、特点 2.标本的正确采集 3.报告单内容解释 4.相关知识： (1)区分感染、定植与污染 (2)药敏试验药物选用原则及结果解释 (3)常见多重耐药菌的特点及用药原则 (4)常见菌药敏情况,一、微生物检验的 方法与特点,革兰阳性菌 革兰阴性菌,细菌染色分类,革兰染色：丹麦Christain Gram(1884),涂片检菌项目,真菌涂片检查 抗酸杆菌涂片检查 G-双球菌涂片检查 新型隐球菌涂片检查 一般细菌涂片检查,曲霉菌（KOH法）,眼分泌物中的镰刀菌,细胞内吞噬的G-双球菌,肺炎链球菌,细胞内吞噬的G-杆菌,药敏结果解释,

2、敏感（susceptible）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在感染部位达到的药物浓度所抑制或杀灭，感染被治愈。 中介(intermediate) : 指药物在体内生理浓集的部位或允许加大药物剂量治疗时有效；该范围还作为一缓冲区，避免由于微小技术误差导致的结果错误解释。 耐药（resistant）：表示测试菌不能被在体内感染部位所能达到的抗菌药物浓度所抑制，治疗无效。,培养结果的局限性,（1）可能造成假阴性结果的原因 未能在抗生素使用前采集标本 采集和运输标本不理想(可能控制的) 延误了培养时间； 培养环境错误，如温度和气体 培养基营养不支持微生物的生长 病原菌数量很少，或标本量不够检出

3、(敏感度) 身体免疫因子抑制生长 在当时所有培养方法不能培养的微生物(局限性),（2）可能造成假阳性结果的原因 不同患者标本混淆 报告了污染菌(从实验室或标本采集过程中) （3）没有分离到病原菌 也不表明实验室不能检测，其他的疾病有可能象感染性疾病的症状(复杂性),药敏试验（体外）敏感,临床（体内）无效,1.病人相关原因： 免疫抑制，基础疾病严重 感染部位药物浓度低（盆腔、前列腺、脑脊液） 2.药物原因: 给药剂量与方式不当 3.微生物相关原因: 病原确立错误（定植敏感菌）； 接种效应；5105/ml vitro vs 109 /ml vivo 毒力（猩红热、吸入性炭疽、EHEC）； 治疗中出

4、现耐药（葡萄球菌-喹诺酮、铜绿、诱导耐药突变）； 产生生物膜（铜绿）,药敏试验（体外）耐药,临床（体内）有效,1. 病人相关原因： 免疫防御（白细胞、补体、抗体、细胞因子）； 感染部位（尿液，胆汁） 2.药物相关原因：增加剂量，延长静滴时间 3.微生物相关原因： 病原确立错误（定植耐药菌）； 致病力（全耐药肺克vs全耐药鲍曼） 药敏折点本身原因 实验室药敏试验操作错误 药敏报告结果中若有敏感的药物，不要选择耐药的药物！,二、标本正确采集,送检标本种类与临床意义,1.临床意义低的标本 痰、咽拭子 粪便、肛拭子 2.临床意义中等的标本 尿 脓、伤口分泌物 3.临床意义大的标本 血、脑脊液、胸腹水、

5、无菌体液,皮肤不是无菌的; 定植细菌“污染”血培养,由污染菌引起的假阳性问题,血培养的关键是防止皮肤寄生菌或环境引起的污染，由污染菌引起的假阳性增加了患者抗生素的使用量，延长了住院日，延误病情诊断并增加了经济负担等。 在理想的消毒条件下，仍有3%5%血培养中混有污染菌，它们来源于皮肤（凝固酶阴性葡萄球菌，痤疮丙酸杆菌，梭杆菌属，类白喉群，草绿色链球菌，微球菌）或来源于环境（革兰阳性芽孢杆菌属，不动杆菌属），这些微生物有时有致病作用. 对两次不同部位血培养生长同一种微生物;不同类无菌部位标本培养中生长同一种微生物;微生物快速生长（48h内）,上述情况应考虑是真正的感染。临床实验室工作人员和医生之

6、间应经常讨论血培养结果，建立良好的交流关系对各方面都有益处。血培养中凝固酶阴性葡萄球菌污染率较高。因此，采血前严格执行皮肤消毒程序非常重要。,感染性细菌性心内膜炎患者血培养采集 急性感染性心内膜炎 抗生素治疗前1-2小时，分别从三个不同部位采集3套血培养标本。 亚急性感染性心内膜炎 1.间隔=15分钟，采集3套血培养标本。 2.如果这些血培养24小时内均为阴性，需再采集2套血培养标本。,摘自卫生部全国临床检验操作规程第三版,血管内导管尖端培养,标本留取 1.用酒精清洁导管周围皮肤。 2.无菌手续移动导管，剪取尖端末端5cm，直接置入无菌容器中。 3.立即运送到细菌室，防止干燥，常规培养不超过1

7、5min，4保存不超过2h。,摘自卫生部全国临床检验操作规程第三版,血管内导管尖端培养,结果解释 1.只有当做血液培养同时，做血管内导管尖端培养，确定患者菌血症的来源。或是抽取新鲜脓性标本培养，确定软组织相关感染，并做在附近有插入导管的尖端段培养。 2.同次血液标本培养和导管尖端培养结果是同种细菌，解释该导管是患者菌血症的源头。,补充内容,脓液组成物是坏死的白细胞和溶解的细菌、组织碎片，自然没有活细菌生长。建议除抽吸脓液送检外，再送检坏死和新鲜交界处的组织取基底部或边缘部采样送检. 这里有血供，细菌营养好，有活力，培养阳性率高。 采集伤口或脓液标本，针吸或组织培养比棉签拭子更可靠 污染率低 菌

8、量足,易培养(涂片阳性率高) 病原体生存时间长 某些细菌生长不被抑制,标本采集原则,尽量在抗生素使用前采集标本 尽量避免定植菌和污染菌的混入 采集到存活的感染菌 标本及时送检,三、报告单内容解释,多重耐药菌评语,1.本菌产超广谱-内酰胺酶（ESBLs），青霉素类、头孢菌素类、氨曲南均对本菌治疗无效。请采取适当措施防控其传播、流行。 2.本菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），对所有-内酰胺类抗菌药物包括头孢类及加酶抑制剂均耐药，并要注意其它药物的多重耐药性，请采取适当措施防控其传播、流行。 3.本菌为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS），对所有-内酰胺类抗菌药物包括头孢类及加酶抑制剂

9、均耐药，并要注意其它药物的多重耐药性，请采取适当措施防控其传播、流行。 4.本菌为耐万古霉素肠球菌（VRE)，因此万古霉素与氨基糖苷类联合治疗无效，并要注意其它药物的多重耐药性，请采取适当措施防控其传播、流行。 5.本菌对高浓度庆大霉素和高浓度链霉素耐药，预示青霉素、氨苄西林或万古霉素和氨基糖苷类抗生素联合对本菌无协同效应。 6.本菌-内酰胺酶阳性预示对青霉素及大多数一代头孢菌素治疗无效，需用含酶抑制剂的-内酰胺类复合剂或对该酶稳定的药物治疗。 7.嗜麦芽假单胞菌产-内酰胺酶，对多数抗生素天然耐药，如氨基糖苷类、多数-内酰胺类，并且对碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南等）天然耐药，请注意合理用药。

10、 8.本菌为黏液型铜绿假单胞菌，此类细菌因生物被膜的屏障作用而使大部分抗菌药物难以渗透，因此即使体外药物实验敏感也会出现临床应用无效的情况，请注意联合用药。 9.该菌株多重耐药，请注意合理用药并采取适当措施防控其传播、流行。,真菌涂片检查,涂片G染色，未见真菌. 涂片G染色，找到酵母样真菌孢子及假菌丝。 涂片镜检，找到曲霉样真菌孢子及菌丝。 墨汁染色，未见新型隐球菌。 墨汁染色，找到新型隐球菌。,抗酸杆菌涂片检查,涂片抗酸染色，未见抗酸杆菌。 浓缩法查抗酸杆菌,未见抗酸杆菌。 涂片抗酸染色，抗酸杆菌偶见（100个视野内3个细菌）。 涂片抗酸染色，抗酸杆菌1+（100个视野内3-9个细菌）。 涂

11、片抗酸染色，抗酸杆菌2+（10个视野内1-9个细菌）。 涂片抗酸染色，抗酸杆菌3+（每个视野内1-9个细菌）。 涂片抗酸染色，抗酸杆菌4+（每个视野内9个以上细菌）。,一般细菌涂片检查,涂片G染色，未见一般细菌。 涂片G染色，找到G+球菌。 涂片G染色，找到G-杆菌。 涂片G染色，白细胞胞浆内可见大量G-杆菌；细胞外可见G+球菌。,G-双球菌涂片检查,涂片G染色，未见G-双球菌。 涂片G染色，细胞内找到G-双球菌。,痰培养,正常菌群生长。 酵母样真菌+，无其它一般致病菌生长。 丝状真菌3+，无其它一般致病菌生长。 棒状杆菌4+，无其它一般细菌生长。,血培养,培养五天无细菌生长。 培养48小时后

12、有微球菌生长。（可疑污染） 培养48小时后，凝固酶阴性葡萄球菌生长。（可疑污染）,尿液培养,培养两天无细菌生长。（无菌体液培养） 凝固酶阴性葡萄球菌少量，1*104 cfu/ml。 G-杆菌少量，1*105 cfu/ml. 肠球菌，1*104 cfu/ml. 酵母样真菌，1*103 cfu/ml。,粪便培养,未检出沙门菌属和志贺菌属。 肠球菌与肠杆菌的比例为2：1，提示菌群失调。 无霍乱弧菌生长。 霍乱弧菌快检:O1群（-） O139群（-）。,酵母菌评语,白假丝酵母菌（白色念珠菌）,菌量4.2*103cfu/ml. （该菌通常对氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、棘白素菌类和多烯类均敏感。） 克柔假

13、丝酵母菌（克柔念珠菌）,菌量4.2*103cfu/ml. （该菌通常对氟康唑耐药，对伏立康唑、泊沙康唑、棘白素菌类和多烯类均敏感。） 光滑假丝酵母菌（光滑念珠菌）,菌量*103cfu/ml. （该菌通常对氟康唑、伏立康唑活性较低，对泊沙康唑、棘白素菌类和多烯类均敏感。）,细菌混合生长,3种细菌混合生长：微球菌1+，凝固酶阴性葡萄球菌2+，草绿色链球菌3+。 3种致病菌混合生长：G-非发酵菌（形似铜绿假单胞菌）3+，凝固酶阳性葡萄球菌（形似金黄色葡萄球菌）3+，G-杆菌（形似肺炎克雷伯菌）1+。 该标本中2种细菌各少量混合生长：G-杆菌，1.7 *103 cfu/ml；G+球菌，1.5*103

14、cfu/ml。 该患者两次留取标本，均为3种细菌各少量混合生长：G-杆菌，2 *103 cfu/ml；G+葡萄球菌，5*103 cfu/ml；G+肠球菌4*103 cfu/ml。,衣原体、支原体检查,衣原体（-）,解脲脲原体（-）,人型支原体（-） 衣原体 + , 解脲脲原体（-）,人型支原体（-） 解脲脲原体+ ,=104 ；人型支原体（-） 解脲脲原体+ ,=104 ； 人型支原体 +，104。,敏感、中介、耐药,MIC折点制定 复杂过程,MIC 是判断药物活性最基本的指标，所指的浓度一般为血药浓度 细菌的MIC值越高，临床实践的疗效越差，治疗的失败率越高,敏感：在正常剂量下，药物在体内达

15、到的浓度能够有效杀死细菌(超过折点的48倍)，则为敏感,中介：如果常规剂量的血药浓度没有达到折点，但药物可以在某些感染部位浓缩而得到更高浓度，或给予高剂量药物以提高血药浓度，能够达到杀死细菌的效果，但程度上低于敏感，则为中介,耐药：当细菌MIC值过高，最大剂量给药后体内药物浓度仍无法达到抑制细菌的浓度时，则为耐药,临床微生物实验室通过药敏试验测量各种药物对于细菌的MIC 根据权威机构制定的折点，判断细菌对何种药物敏感或耐药,四、相关知识,（一）区分感染、定植与污染,金黄色葡萄球菌（甲氧西林敏感/耐药）,脑脊液：皮肤污染、致病（安置有脑脊液分流管道） 血：皮肤污染、致病（来自皮肤软组织或骨感染、

16、脓肿、输液通道、急性心内膜炎、人工瓣膜心内膜炎） 痰：定植、致病（金葡菌肺炎很少见，常仅见于流感病毒感染后） 尿：皮肤污染、致病（少见） 大便：定植、致病（肠炎） 伤口：皮肤污染、定植、致病（脓肿、蜂窝织炎）,凝固酶阴性葡萄球菌（如表皮葡萄球菌）,脑脊液：皮肤污染、致病（安置有脑脊液分流管道） 血：皮肤污染、致病（来自皮肤软组织或骨感染、感染的植入物、人工瓣膜心内膜炎、罕见引起自然瓣膜亚急性心内膜炎） 痰：定植 尿：皮肤污染、致病（腐生葡萄球菌） 大便：定植、致病（肠炎） 伤口：皮肤污染、定植、致病（脓肿、蜂窝织炎）,粪肠球菌、屎肠球菌,脑脊液：非致病（多数情况）、致病（V-P分流管感染或与粪

17、小杆线虫的重叠感染）； 血：皮肤污染、致病（胃肠道或生殖道来源、亚急性心内膜炎） 痰：非致病 尿：污染、致病 大便：非致病 伤口：定植、致病（蜂窝织炎）,草绿色链球菌群,脑脊液：非致病（多数情况）、致病（合并有亚急性心内膜炎） 血：皮肤污染、致病（败血症或亚急性心内膜炎） 痰：非致病 尿：非致病 大便：非致病 伤口：非致病,肺炎链球菌,脑脊液：致病（急性化脓性脑膜炎） 血：致病（呼吸系统来源） 痰：定植、致病 尿：非致病 大便：非致病 伤口：致病（仅见于SLE患者的蜂窝织炎）,大肠埃希菌,脑脊液：致病（急性化脓性脑膜炎） 血：致病（源自胃肠道和泌尿生殖道） 痰：致病（呼吸机相关性肺炎，罕见引起

18、社区获得性肺炎） 尿：定植、致病 大便：定植、致病 伤口：致病（蜂窝织炎）,肺炎克雷伯菌,脑脊液：致病（急性化脓性脑膜炎） 血：致病（源自呼吸系统、胃肠道和泌尿生殖道） 痰：定植、致病（社区获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎） 尿：定植（安置尿管后）、致病 大便：非致病 伤口：定植、致病,鲍曼不动杆菌,脑脊液：皮肤污染、致病（急性化脓性脑膜炎） 血：致病（来源于输液通道、肺或尿路） 痰：定植、致病（呼吸机相关性肺炎） 尿：定植、致病（导管相关性尿路感染） 大便：非致病性 伤口：定植（多见）、致病（少见）,铜绿假单胞菌,脑脊液：非致病 血：致病（源自呼吸道和泌尿生殖道） 痰：定植（多见）、致病（少见，

19、呼吸机相关性肺炎） 尿：定植、致病（来源于尿路侵袭性操作） 大便：非致病 伤口：定植（几乎总是定植）,曲霉菌,脑脊液：致病（仅见于有播散性感染者） 血：污染、致病（原发性或来自肺） 痰：定植、致病；（注意：痰中分离出曲霉菌不是侵袭性曲霉菌病诊断依据） 尿：非致病 大便：非致病 伤口：非致病、致病（罕见于大面积创伤者）,白色念珠菌,脑脊液：致病（仅见于有播散性感染者） 血：污染、致病（原发性或来自输液管道） 痰：定植（绝大多数）、致病（仅见于有播散性感染者） 尿：定植、致病 大便：定植（是尿中念珠菌的来源） 伤口：非致病,综合分析以区分感染、定植、污染,病原学检查结果阳性，也要根据临床症状、感染

20、相关指标是否升高、相关辅助检查结果、感染部位、细菌致病特点，综合分析判断是否为真正的感染菌。(医生也要了解不同部位可能的感染菌有哪些，能根据感染特点评估可能的致病菌以利于经验选用抗菌药物。）,（二）药敏选用原则,1.葡萄球菌属药敏试验所选药物,葡萄球菌药敏结果解释 青霉素敏感的葡萄球菌对被FDA批准用于葡萄球菌感染治疗的其他青霉素类、-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类和碳青霉烯类也敏感。 青霉素耐药、苯唑西林敏感的菌株对-内酰胺酶不稳定的青霉素耐药，对其他-内酰胺酶稳定的青霉素、-内酰胺酶抑制剂复合物、相关头孢类和碳青霉烯类敏感。 苯唑西林耐药的葡萄球菌对目前所有的-内酰胺类抗生素耐药。 因此，通

21、过只检测青霉素和苯唑西林（或头孢西丁）就可以推知很多其它内酰胺类药物是敏感或耐药。所以没有必要常规检测其他的青霉素、内酰胺酶抑制剂复合药、头孢类和碳青霉烯类。,对-内酰胺酶不稳定的青霉素 氨苄西林、阿莫西林、阿洛西林、羧苄西林、哌拉西林和替卡西林 耐-内酰胺酶青霉素 苯唑西林、氯唑西林,2、肠球菌属药敏试验所选药物,肠球菌药敏结果解释1 青霉素敏感,非产-内酰胺酶肠球菌可预报其对氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦敏感。 对于肠球菌，头孢菌素、氨基糖苷类、克林霉素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑可以在体外显示活性但临床上无效。,肠球菌药敏结果解释2 高水

22、平氨基糖苷类筛选试验，能够预测氨苄西林、青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗生素之间的协同效应。 严重的肠球菌感染，如心内膜炎，需要氨苄西林、青霉素、或万古霉素加一种氨基糖苷类药物进行联合治疗，对肠球菌可起到协同杀菌效果。除非证明其对庆大霉素和链霉素高水平耐药。,3、肺炎链球菌药敏试验所选药物,4.肠杆菌科药敏试验所选药物,肠杆菌科药敏结果解释 关于超广谱-内酰胺酶（ESBLs）问题 对青霉素类，头孢菌素类及单环内酰胺类抗生素耐药 随着三代头孢菌素治疗时间的延长，肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷氏菌属细菌可发展为耐药，最初分离的敏感菌株在开始治疗3-4天内可变为耐药，应重复药敏试验。 第一、二代头孢

23、菌素和头霉素类在体外可能表现对沙门菌属和志贺菌属有活性，但临床无效。,5、铜绿假单胞菌药敏试验所选药物,非发酵菌细菌药敏结果解释 铜绿假单胞菌 长期用各种抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，治疗3-4天应重复进行药敏试验。,6、不动杆菌属药敏试验所选药物,洋葱伯克霍尔德菌 嗜麦芽窄食单胞菌,抗真菌药物在体外对真菌病原学活性,无活性；+/可能有活性； +有活性，三线（至少临床有效）+有活性，二线（作用稍差）；+有活性，一线（常常有效）,抗真菌药物在体外对真菌病原学活性,无活性；+/可能有活性； +有活性，三线（至少临床有效）+有活性，二线（作用稍差）；+有活性，一线（常常有效,常见革兰阴性

24、菌的天然耐药,1变形杆菌属对多粘菌素B/粘菌素耐药。2 普罗威登斯菌属对除了阿米卡星和链霉素外的所有氨基糖苷类耐药，对四环素耐药。 3 沙雷菌属对呋喃妥因耐药。4 铜绿假单胞菌还对卡那霉素、新霉素、复方新诺明天然耐药。,常见革兰阳性菌的天然耐药,（三）多重耐药,细菌耐药是当前临床抗感染治疗的热点和难点 出现了无药可用的细菌感染,多重耐药菌流行,1.革兰阴性杆菌 (1) 产生-内酰胺酶 ESBL （超广谱内酰胺酶） AmpC酶 产碳氢霉烯酶的肠杆菌科细菌 (2)泛耐药 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 2.革兰阳性球菌 PNSP-青霉素耐药的肺炎链球菌 MRSA-苯唑西林耐药的金葡菌 VRE-万古霉素

25、耐药的肠球菌 VRSA-万古霉素耐药的金葡菌,我们目前面临的主要耐药问题,常见菌耐药特点及用药原则,1.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌是产质粒介导的超广谱-内酰胺酶（ESBL）的代表菌种。ESBL能被-内酰胺酶抑制剂所抑制，对三代头孢菌素耐药。产酶率高达50%以上。ESBL（+）的细菌对-内酰胺类（不包括含加酶抑制剂）、氨曲南均耐药。ESBL（+）的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌经验用药应选用亚胺培南、美罗培南、含加酶抑制剂的复方制剂和其他敏感的抗菌药。高产AmpC酶是导致阴沟肠杆菌对大多数-内酰胺类药物耐药的主要原因。,常见菌耐药特点及用药原则,2.葡萄球菌：耐苯唑西林的葡萄球菌（MRS）,对目前所有的

26、头孢类和其他-内酰胺类（包括含加酶抑制剂）抗生素均报告耐药，即使体外实验显示敏感，也应报告耐药。（青霉素、头孢菌素、含酶抑制剂的复方制剂、碳青霉烯类、氨曲南）。,常见菌耐药特点及用药原则,3.铜绿假单胞菌（PA）是条件致病菌，当机体免疫力低下时可引起多种感染。近年来其耐药性越来越严重，表现为多重耐药。PA可产生多种酶，如ESBLS、质粒介导的AmpC酶，碳青霉烯酶、金属酶等。PA对氨苄西林天然耐药。对耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌应选用：环丙沙星、氨基糖苷类、多粘菌素或根据药敏结果选用，通常需要联合用药。,黏液型铜绿假单胞菌治疗建议联合大环内酯类抗生素,常见菌耐药特点及用药原则,4.鲍曼不动杆菌（

27、Ab）是机会致病菌，多重耐药菌逐年增加，并且在全球范围内对亚胺培南的耐药率已出现快速增长，耐药机制较为复杂，多为产酶所致。治疗时应用舒巴坦复方制剂，如氨苄西林/舒巴坦，头孢哌酮/舒巴坦；多粘菌素，联合用药（如氨基糖苷类与上述药物联合）， 多粘菌素B、亚胺培南及利福平三药联合； 替加环素 。,常见菌耐药特点及用药原则,5.嗜麦芽窄食单胞菌临床标本中的分离率有增加趋势，其独特的固有耐药性应受到关注。嗜麦芽窄食单胞菌天然耐碳青霉烯类药物。,常见菌耐药特点及用药原则,6.肺炎链球菌在机体抵抗力下降时，可引起多部位的炎症。近年来耐青霉素的肺炎链球菌（PRP）及多重耐药株的增加，使得以往用药模式已不能适应当前的耐药情况，红霉素、克林霉素和复方新诺明在近年统计资料中显示高度耐药，耐药率高达80%以上。经验治疗时应首选阿莫西林、头孢曲松或头孢噻肟、喹诺酮类和万古霉素等。,7.肠球菌：主要是粪肠球菌和屎肠球菌。对于肠球菌属，头孢类、氨基糖苷类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑可以在体外显示活性但临床上无效。肠球菌