疟原虫的制片技术

1、疟原虫的制片技术,.,内 容,（一）血片制作 （二）染 色,.,所需设备,载玻片：清洁无油污，以免血膜受污染或脱落 推 片：边缘光滑，用完后及时清洗，以免影响下次使用 微量采血吸管：20ul，取血时可供参考 胶 头：与微量采血吸管配套，注意不要吸进血液 取血所用的设备：75%酒精棉球、一次性采血针、抗凝管等 记号笔：写标签 水、纸巾：用于清洗、拭干推片,.,样本要求,末梢全血：指尖、耳垂末梢全血，婴幼儿可取拇趾或足跟部全血。现场取血现场制片。 静脉全血：采用抗凝管采血。最好取血后立即制片，如果血液放置时间过长会影响镜下形态。冷冻后的血液不能用于制片。 骨 髓：临床上可用于确诊恶性疟感染，可查到

2、恶性疟大滋养体和裂殖体。 注 意：（1）用抗疟药之前取血（用药后镜检结果往往是阴性）；（2）取血后应尽快制片（血细胞和疟原虫的形态保存完好）。,.,血膜的种类,用于检查疟原虫的血膜用两种： 一种是将血液涂成薄膜状，称为薄血膜； 一种是将血液涂成圆盘状，称为厚血膜。,要求：一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜！,.,血膜的位置,标准血片： 每张玻片涂厚、薄血膜各1个 方 法： 将载玻片平均分为6等份：第1、2格用于贴标签；厚血膜涂在第3格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部 外 观： 血片自左向右依次为薄-厚-标签,.,厚血膜的制作,方 法： 取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置，取约45ul血（

3、相当于火柴头大小），右手持推片下端，使推片一角与血滴中心接触，由里向外一个方向旋转24圈，最后再回到中心，涂成直径0.81cm大小圆形厚血膜。 位 置： 玻片中央偏右或6等份中的第3格中部。 外 观： 圆形，厚薄均匀，边缘整齐。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。以1个油镜视野5-10个白细胞为宜。 注 意： 厚血膜制作完成后一定要平放，倾斜会导致厚薄不均匀，容易脱落。,.,薄血膜的制作,方 法： 取约11.5ul的血（相当于1/4火柴头大小），使推片与平置的载玻片在血滴前方密切接触，并形成2535夹角，后拉推片与血滴接触，待血液向两侧扩展约 22.5cm宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄

4、血膜（约2.5cm长）。 位 置： 玻片左半部分或第4格前缘到第6格中部。 外 观： 舌状，厚薄均匀，无划痕。在玻片上形成平铺的红细胞，红细胞之间互相接触而不相互重叠。 注 意： 推制时速度要均匀。血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等会影响血膜的厚薄。,.,正确的推片姿势,.,标准的疟原虫血片,.,10,制片注意事项,玻片清洁无磨损 载玻片必须完全清洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。推片边缘一定要平滑、清洁，才能使推出的血膜均匀一致，边缘无毛刺。 刚涂制的血膜要平放 厚血膜未干前切勿倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均

5、，厚处不易溶血和着色而影响检查结果。晾干血膜时应注意防尘，防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜。干后应及时装入标本盒并盖严。,.,制片注意事项,血膜应自然干燥 切忌在毒太阳下晒或用火烤，加快其干燥可采用放手背或衣服上摩擦、冷风吹。血膜干透后才能用甲醇固定薄血膜。 血膜应及时处理 夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟），然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入盒内盖严，待以后染色。,.,内 容,（一）血片制作 （二）染 色,.,染液的种类,目前临床上应用最广泛的是瑞氏染液和吉氏染液。 我们推

6、荐用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。 瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。,.,染色前的处理,无论用吉氏染液还是瑞（吉）氏染液，染色前均需要对薄血膜进行固定，对厚血膜进行溶血处理。 薄血膜固定：将血片薄血膜朝下，呈45倾斜，用吸管吸取一定量的甲醇或无水乙醇进行固定。 厚血膜溶血：将清水滴加于厚血膜上或将厚血膜向下插入水槽中，待厚血膜表面呈白色即可。 注 意：（1）固定薄血膜时甲醇一定不要碰到厚血膜；（2）厚血膜溶血后需要晾干再进行染色，否则厚血膜很容易脱落。,.,注 意：母液的稀释用水尽量选用pH为7.0-7.2的缓冲液。 原

7、因：当染液的pH值为7.0-7.2时染色效果较好，疟原虫的胞浆被染成蓝色，疟原虫的核被染成红色。 染液偏酸时，红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而疟原虫的胞浆着色较差。 染液偏碱时，红细胞被染成紫蓝色，不易观察。,.,吉氏染液的染色方法,染色前的处理： 血膜干燥后,先用甲醇或无水乙醇固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白（新制作的血片可省略这一步骤，因染液中含较高浓度的水，在染色过程中进行溶血），然后再进行染色。 染液的配制： 每1ml缓冲液或蒸馏水，加吉氏母液2-3滴；或将母液和缓冲液按照1:9的比例混合。 染色方法： 每张血片约需要染液2ml，将染液混合均匀，滴加于血膜上并覆盖整个血膜，染色

8、15-20min。然后用清水轻轻将染液冲洗干净，晾干后镜检。,.,瑞（吉）氏染液的染色方法,染色前的处理： 血膜干燥后,先用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，待厚血膜晾干后，直接进行染色。（这种染色方法省略了固定薄血膜这一步骤，因染液中含较高浓度的甲醇，在染色过程中对薄血膜进行固定）。 染液的配制和染色方法： 根据说明书操作。,.,染色注意事项,（1）滴加染液时吸管不要碰到血膜，否则容易出现划痕； （2）滴加染液时不要出现气泡，否则影响着色； （3）勿直接倾倒掉玻片上的染液，以防渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检； （4）冲洗染液的水流一定要轻缓，不要对着厚血膜冲，否则厚血膜直接被冲掉；如果用漂洗的方法，

9、将血片倾斜着从水盆中取出。 （5）一定不要染反了！,.,影响染色效果的因素,血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色技术等有关外，还受到以下因素的影响： （1）染液稀释后使用时间 必须现用现稀释，当时使用，一般在0.5h内染色力最强。吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在甲醇中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀，从而失去染色能力。 （2）染液的稀释浓度 染液的浓度要适当。染液的浓度高，着色就快而深，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。,.,影响染色效果的因素,（3）染色时间 染色时间长染色效果好，反之较差。染色时间应根据染液的稀释浓度和气温而适当增减。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。 （4）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择pH7.0-7.2缓冲液，也可以使用新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水。 （5）冲洗方法 应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒附着于血膜。,.,不