1.2基因工程的基本步骤(定稿)2.22.ppt

1、1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,棉花细胞,苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,棉花植株(有抗虫特性),导入,(含抗虫基因),基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,目的基因导入受体细胞,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,步骤一：目的基因的获取,如:苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，植物的抗逆性相关的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,目的基因：是指编码蛋白质的基因。也可以是具有调控作用的因子。是人们需要转移或改造的基因。P9,获取方法：,（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成 P11,（1）从基因文库中获取目的基因；P9,（2）利用P

2、CR技术扩增目的基因；P10,（1）从基因文库中获取目的基因；P9,获取方法：,基因文库:P9,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库(gene library)。,基因组文库:P9,基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。（请写一写）,部分基因文库（如：cDNA文库）P9,基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。（请写一写）,1、基因文库的构建方法：,基因组文库的构建,通过培养受体菌的方式储存基因,某生物DNA,限制性内切酶,DNA片段,连接到载体上,导入受体菌,

3、受体菌,（1）从基因文库中获取目的基因；P9,获取方法：, cDNA文库的构建 （反转录法）,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),连接到载体上,导入受体菌,受体菌,1、基因文库的构建方法：,（1）从基因文库中获取目的基因；P9,获取方法：,2、从基因文库中得到目的基因的方法,依据：目的基因的有关信息。P9,基因翻译产物蛋白质等特性,基因的转录产物mRNA,基因在染色体上的位置,基因的功能,如：根据基因的核苷酸序列,（1）从基因文库中获取

4、目的基因；P9,获取方法：,（2）利用PCR技术扩增目的基因；P10,获取方法：,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_ _复制_ _的核酸合成技术。,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,条件：_ _、_ _、_ .,原理：_,DNA复制,已知基因的核苷酸序列（模板）,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环次数）,结果：,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,（2）利用PCR技术扩增目的基因；P10,获取方法：,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引

5、物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,（3）人工合成 P11,获取方法：,若基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪用化学方法人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,步骤二：基因表达载体的构建（核心步骤）,载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能遗传给下一代，同时能够表达并发挥作用。,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,启动子：位于基因的首端的

6、一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,标记基因：作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,步骤二：基因表达载体的构建（核心步骤）,步骤三：将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,（1）将目的基因导入 植物细胞,（2）将目的基因导入 动物细胞,（3）将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（1）

7、将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法（植物常用方法）,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。P12,原理：当植物受损伤时，伤口处细胞分泌酚类化合物，吸引农杆菌吸移向这些细胞，这时农杆菌的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。P12,过程：,请看P12,农杆菌转化法（植物常用方法）,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。P12,原理：当植物受损伤时，伤口处细胞分泌酚类化合物，吸引农杆菌吸移向这些细胞，这时农杆菌的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到受体细胞，并整合

8、到受体细胞染色体的DNA上。P12,优点：,经济有效，目前约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。,过程：,请看P12,（1）将目的基因导入植物细胞, 基因枪法 P12,这是单子叶植物常用的方法，但成本较高。, 花粉管通道法 P13,如：抗虫棉。简便经济。,（1）将目的基因导入植物细胞,方法：显微注射法,步骤：,（2）将目的基因导入动物细胞,显微 注射,分裂 分化,移 植,发 育,目的基因表达载体提纯,动物的 受精卵,含目的基因的受精卵,早 期 胚 胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因 动 物,（3）将目的基因导入微生物细胞 P13,繁殖快、单细胞、遗传物质少,原核生物：,方法：,用Ca2+处理

9、细胞,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,步骤四：目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性。,2、分子水平的检测,A、检测是否插入了目的基因,（DNA分子杂交技术）,步骤四：目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,.首先取出转基因生物的基因组DNA P14,.在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素作标记,以此做探针,.使探针和转基因生物的基因杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体的DNA中,A、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,变性,标记,杂交,步骤四：目的基因的检测与

10、鉴定,检查是否成功,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性。,2、分子水平的检测,A、检测是否插入了目的基因 B、检测是否转录出了mRNA,（DNA分子杂交技术）,（DNA-RNA分子杂交）,C、检测是否翻译成蛋白质,（抗原-抗体杂交）,3、个体生物学水平的检测,-做抗虫或抗病的接种实验,个体水平定鉴,DNA分子杂交,显示出杂交带,分子杂交技术,显示出杂交带,抗原抗体杂交,显示出杂交带,接种,抗性以及抗性,步骤四：目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,总结: 基因工程的基本操作程序,1、获取目的基因 从基因文库提取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合

11、成 从供体细胞直接提取 2、构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3、将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、Ca+处理法 4、目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译、个体检测,1.下列操作不属于基因表达载体构建过程的是（ ） A. 用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端 B. 用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端 C. 将切下的目的基因片段插入质粒切口处 D. 将重组DNA导入受体细胞中,D,课堂自我检测,2. 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的珠蛋白，想

12、一想，应该如何设计？,1. 从鼠体内提取珠蛋白的基因 2. 珠蛋白的基因表达载体的构建 3. 珠蛋白的基因导入大肠杆菌 4. 珠蛋白的基因的检测和鉴定,课堂自我检测,3. 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是（） 检测受体细胞是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转录mRNA 检测目的基因是否翻译蛋白质 A B. C. D. ,C,课堂自我检测,4.1976年人类首次获得转基因生物，即将人的生长素抑制因子基因转入大肠杆菌，并获得表达。这里的表达是指该基因在大肠杆菌内（） A. 能进行DNA复制 B. 能进行转录和翻译 C. 能合成生长素抑制因子 D. 能合成人的生长激素 5. 下列说法正确的是（） A. 基因表达载体的构建方法是一致的 B. 标记基因也叫做抗生素基因 C. 显微注射技术是最为有效的一种将目的基因导入植物细胞的方法 D. 大肠杆菌是常用的微生物受体,C,D,6. 将目的基因导入微生物细胞之前，要用Ca2处理细胞，处理