超高效液相色谱法.ppt

1、杨百翰大学的乔根森博士和李博士最近发表了关于色谱实验室未来分析范围的深刻见解。他们的研究为分离科学描绘了一幅新的图景。通过使用比以前小得多的粒子，分离过程达到了一个新的终点。范迪姆方程是描述线速度和塔板高度(塔效率)之间关系的经验公式。从图1可以看出，一旦填料粒径小于2 m，色谱技术就可以达到一个新的水平：不仅柱效更高，而且柱效也不会随着流速的增加而降低。如果使用UPLCTM技术和2米以下的颗粒，即使在高线速度下也能保持效率。使用较短的色谱柱和/或较高的流速加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏度，并使充分利用色谱分离原理成为可能。峰容量定义为单位时间内色谱可分辨的峰数。具有改进的峰值容量和分离速

2、度的色谱被称为超高效液相色谱，或UPLC。图2说明了当颗粒尺寸从5米减小到1.7米时，峰值容量增加对色谱分离性能的影响。来自较小颗粒的额外效率可以带来更明显的益处。较短的色谱柱或较高的流速可以提高速度，而较小的颗粒可以提高分辨率。对于任何给定的分离，速度和分辨率的最佳组合可以通过调整这些变量来实现。头发的直径大约等于12个5米的颗粒和33个1.7米的颗粒。图4显示了实验室中常用的5米粒子和推荐用于UPLC色谱柱的1.7米粒子之间的明显差异。目前，无孔1.5 m颗粒已经投放市场。虽然这些颗粒是有效的，但它们的缺点是表面积小。小的表面积导致小的样品装载和短的保留时间。为了保持保留时间和样品装载与高

3、效液相色谱相似，UPLC必须使用多孔颗粒。UPLC需要一种新型的耐高压多孔颗粒。填充床的均匀性也非常重要。特别是当使用较短的柱来保持分辨率稳定，同时达到加速分离速度的目的时。另一个要求是，色谱柱的内表面必须足够光滑，以填充较小的颗粒。色谱柱两端的筛板应重新设计，以保持小颗粒，避免堵塞。3 m是15厘米长普通色谱柱的粒径极限。这是在色谱柱达到最佳流速且不超过市售仪器的压力极限范围(使用任何比例的甲醇-水混合溶剂)的条件下，可用于运行系统的最小粒径。(注：到目前为止，高效液相色谱中使用的最小颗粒为0.67米。为了实现小颗粒和大峰值容量的分离效果，有必要具有比目前使用的高效液相色谱仪器更宽的压力范围

4、。在最大效率的最佳流速下，对于含有1.7米颗粒的10厘米色谱柱，计算的压降为15，000磅/平方英寸。因此，需要一个能够在该压力下输送溶剂的泵。在这些条件下，溶剂的可压缩性将变得显著，特别是在多溶剂和梯度分离的条件下。UPLC的溶剂输送系统不仅要有高压泵的泵送功能，还要以等度和梯度分离的方式使用各种溶剂。溶剂输送系统必须能够抵消由溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动，从而实现平稳且可重复的流体输送。普通的喷射阀，无论是手动的还是自动的，在极端压力下都没有持久的功能。分析应用需要注射的重复性和线性的典型性能标准。为了保护色谱柱不受极端压力波动的影响，注射过程中应尽可能消除脉冲干扰。仪器的系统体积

5、应该很小，以减少检测样品可能出现的频带展宽。在快速进样循环中，UPLC可以在最大速度和大样品流量下工作。理论上，配备有1.7米粒子的UPLC系统可以产生半宽度小于1秒的探测峰值。这给UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须具有高采样速率，以便在检测峰通过时捕获足够的数据点，从而准确且可重复地识别(和积分)分析物的检测峰，并且检测器必须具有最小的扩散体积，以确保分离效率不会降低。探测器的光学组件还必须具有反映UPLC灵敏度优势的性能指标。从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC检测的灵敏度应该是高效液相色谱分离的2-3倍(图5)。例如，质谱将极大地受益于UPLC的性能特征，这将使连接到UPLC的

6、质谱仪的灵敏度提高至少3倍。在峰容量的色谱分析中，减少分析物的色谱展宽可能有助于提高灵敏度。除化学、泵、注射器和检测器外，还应考虑系统。系统的体积非常重要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分离的高性能，UPLC的总系统体积必须比目前的高效液相色谱系统低得多。例如，考虑到连接管道和配件，UPLC技术可以实现提高液相色谱的速度、分辨率和灵敏度的承诺，并为每次分析提供更多信息；因此，这项技术将被实验室广泛认可。UPLC优于高效液相色谱的优点如下：1 .速度UPLC采用了一种新型的全多孔球形1.7m反相固定相，它是利用混合粒子技术(HPT)合成的，从而制备了一种高效的ACQUITY UPLC色谱柱。

7、这使得在常规高效液相色谱中需要30分钟的样品分析在超高效液相色谱中只需要5分钟，并且显示出200，000柱/米理论板的超高柱效率。灵敏度我们知道UPLC色谱柱使用1.7米的固定相，通过分离获得的色谱峰的半峰宽小于1秒，这需要非常高的检测器。阿基蒂UPLC公司使用一种新的光纤，其采样速度为40点/秒，流通池容积仅为500微升(约为高效液相色谱池容积的1/20)。当光束通过光纤进入流通池时，利用聚四氟乙烯细胞壁的总发射特性，在不损失大部分光能的情况下，检测灵敏度比高效液相色谱提高了23倍。光源可以使用波长可变的紫外光或二极管阵列系统。自动化对于UPLC的注射系统，传统的手动注射阀和自动注射阀不能满

8、足系统要求。在UPLC，为了保护色谱柱不受极高压力波动的影响，进样过程应相对没有压力波动，进样系统的死体积必须足够小，以减少样品带的扩展。UPLC自动取样器的设计有了新的突破：针内取样探针(XYZZ)是一种能快速取样的高速取样机器。内针的含义是用液相色谱管道(聚醚醚酮材料)作为注射针，以减少死体积，而“外针”是一个用来刺穿样品瓶盖的短硬管；压力辅助进入。为了减少注射过程中的交叉污染，采用了强、弱双溶剂注射针头清洗步骤，两种针头清洗溶剂需要同时脱气。该技术可确保可靠且可重复的注射；在自动进样器中，可以放置96位或384位样品托盘。每个位置可放置2或4毫升小瓶。新的样品组织器可以接受21个样品托盘

9、的编程。与传统的高效液相色谱相比，UPLC的速度、灵敏度和分辨率分别是高效液相色谱的9倍、3倍和1.7倍。因此，它将广泛应用于蛋白质、肽、代谢组学分析等生化领域。此外，在天然产物的分析中，使用UPLC连接质谱检测器将极大地促进天然产物分析的发展，特别是中药研究领域。当涉及到蛋白质组学或代谢组学时，没有组的区别在于样本量巨大，需要在短时间内分析成千上万的样本。在不损失分辨率的情况下，UPLC的高速优势可以在中得到充分展示。多生化样品和天然产品非常复杂，沃特世UPLC和莱克斯拉UHPLC LC-30A2.超快速进样通过重叠进行，进样时间最短，每次进样只需10秒钟。3.最大化样品容量Nexera换架

10、器，最多可处理4，600种样品；多路传输系统(MPX)。性能优化：1 .在微量分析中，交叉污染被最小化，并且最小接触面积通过注射针；可使用多种溶剂(最多4种)彻底清洁样品流路和注射针表面。2、用体积最小、准确、准确的样品进样采用高分辨率计量泵直接进样；计量泵独立于流路。3.确保在超快条件下良好的梯度再现性和高分辨率梯度控制；MiRC混合器的有效混合机制。适合UHPLC的平衡塔加热，使IHB控制的塔间温度分布最小化；通过微体积预热器，可以对其进行有效预热。最大化扩展性1。可升级的UHPLC组件设计可以通过组合常用的高效液相色谱组件自由配置系统。2.使用自动进样器，样品可以自动预处理，包括柱前衍生

11、、内标添加和样品稀释。3、高温分析柱温度高达150；高温促进了绿色液晶等新技术的应用。4.结合高速LCMS分析与超高速LCMS和LCMS-2020。超高效液相色谱法测定头发中的尼古丁和可替宁尼古丁是烟草中的主要生物碱，是导致吸烟成瘾的物质原因，也是评价人体吸烟量的常用指标。可替宁是尼古丁在体内的主要代谢物，也是评估烟草烟雾摄入量的生物标志物。测定头发样品中尼古丁和可替宁的含量可以反映人们长期接触烟草烟雾的情况，为流行病学调查提供定量依据，评价烟草烟雾对人体健康的影响。本文用UPLC法测定了主动吸烟者和被动吸烟者头发中的尼古丁和可替宁。日本岛津的超快速液相色谱仪prominenceuflc已将快

12、速分析作为一项重要的技术课题。然而，随着LCMS的迅速普及，提高性价比已经成为一个迫切的问题，成为加快速度的一个重要因素。快速分析意味着缩短分析时间，这通常通过缩短色谱柱或增加流动相的流速来实现。使用小粒径填料将使这种方法快速分离成为可能。然而，由于色谱柱中流动阻力的增加，仪器各部分和色谱柱上的压力也会显著增加。高温分离可以加速物质的扩散，降低色谱柱中的流动阻力，使快速分离成为可能。高温分析对降低柱压非常有效，但在应用中应注意高温引起的柱劣化和样品分解等缺点。UFLC通过以下特征支持快速分析：小柱管和小流动池减少了柱外的峰加宽效应。自动进样器采用2.2米粒径色谱柱，可在10秒内实现10l的超快速进样，支持高达85的高温分析。温度和快速分析：随着柱温的增加，理论塔板数增加，柱效增加，柱压降低。温度对化合物的影响高温分析在降低柱压方面非常有效，但在使用时需要注意。高温分析仅用作快速分析的辅助手段。高采样频率的探测器可以在不丢失信息的情况下实现快速数据采集。特殊的色谱方法转换软件使常规色谱条件转换成UFLC条件变得容易，保证了分析方法的通用性。快速分析的再现性在快速分离中获得组分保留时间的再现性比在常规分析中更困难。保留时间的重现性与时