现代药理学.ppt

1、一氧化氮及其药物活性,王玲 2011.5.9,现代药理学,NO生物活性发现简史,自1980年发现血管舒张依赖于内皮细胞释放的内皮源性松弛因子及1987年证明内皮源性松弛因子本质是一氧化氮后，对一氧化氮的研究引起世界医学界的广泛关注，以至于被认为是2泄纪最伟大的发现之一，一氧化氮也因此被（Science) 杂志选为1992年的年度分子。,一氧化氮的化学性质,NO参与的反应总共可以分为两大类：自由基反应和极化反应。 NO主要作为自由基参与反应时，一般都需要催化量的氧气参与，通过NO2引发，从而发生自由基反应；另外， NO在与碳负离子或极化较强的不饱和双键的反应过程中，表现出亲电的性质。,一氧化氮(

2、 nitric oxide, NO )是一个气态双原子分子，是一种无机小分子，分子量只有30，类似自由基，虽然不带电荷，但含有一个未配对的电子，具有很强的化学活性。,NO有毒性，半衰期较短(5s)，在有氧的情况下， NO相对不稳定，很快自氧化形成氧化氮。,NO有毒性，半衰期较短(5s)，在有氧的情况下， NO相对不稳定，很快自氧化形成氧化氮。,NO的共振形式,NO空间结构,NO的棍棒式结构,NO的结构,NO的生物活性,NO基本的也是很重要的一种生物学作用就是其作为细胞间的信息递质。在大多数细胞组织中，N0都作为信号的传递体，通过激活鸟苷酸环化酶(Gc)来发挥作用。NO在生物合成释放后，由于其亲

3、脂性的特点，迅速在邻近的细胞问扩散，并与其中含有GC的血红素基团(Heme)结合，形成NO-Heme-GC复合物。这样，鸟苷酸环化酶就被激活了。活化的GC使细胞内的cGMP产生并大量堆积，从而发挥其松弛血管平滑肌、抑制血小板凝聚以及中枢神经传导等生理功能。,NO激活鸟苷酸环化酶的过程,鸟苷酸环化酶参与信使过程,NO的生物活性,生物体内NO 表现出两重性: 在生理状态下L-A rg经细胞内原生型NOS途径生成低浓度的NO, 发挥信号传递、维持血管张力等生理作用; 在病理条件下则通过激活诱生型NOS持续产生大量NO, 由此途径生成的NO 往往表现为细胞毒性作用。,NO 在中枢神经系统发挥着重要的中

4、枢调节作用 NO对血液循环系统的正常功能起着重要的调节作用 NO参与非肾上腺素能、非胆碱能的神经传递，以及长短期记忆、吗啡镇痛和男性性功能的调节等多种生理过程 NO还参与了抗体的抗感染、抗炎症、抗肿瘤等各种防御机制。,NO的生物活性,一氧化氮的生物合成,已经证实，一氧化氮(NO)是L一精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合成酶(NOS)作用下、L-Arg的胍基氮原子末端的5个电子被氧化形成L一胍氨酸(CIL)的同时生成NO,内源性NO由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)生成,一氧化氮合酶三种亚型,eNOS又分为内皮型NOS(eNOS)和神经元型NOS(nNOS)。,NOS分为固有型(

5、eNOS)和诱导型(iNOS)两类,NOS是NO体内合成的限速酶,这些亚型是由不同染色体上三个相异基因所编码，它们彼此以及和细胞色素P450酶之间约有50%-60%的同源性,NOS介绍,神经型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶存在于细胞内，只在短时间内释放少量的一氧化氮，维持体内正常水平的NO浓度，保证体内各项机能的正常，如血压等。,正常情况下诱导型一氧化氮合酶不表达，当受到体内非正常因子如促炎因子刺激后可产生大量的一氧化氮，参与体内的炎症反应。,NOS在体内的分布,iN-0S主要分布在巨噬细胞、白细胞等炎症细胞中，由炎症刺激诱导表达，产生大量的NO参与介导炎症反应； eNOS主要存在于血管内皮

6、、平滑肌等细胞中，生理状况下维持基础水平的表达，产生的NO参与正常血管张力的调节； nNOS主要存在于神经元，生理状况下亦维持基础水平的表达，产生的NO参与正常的神经生理活动。,NOS在体内的分布,NOS结构与功能,三种NOS只有在结合辅基并形成二聚体才有催化活性 NOS的辅助因子包括NADH，Ca2+，FAD，NH4B，而有机汞、氨基胍和咪唑类化合物能与活性中心结合，显著地抑制NOS的催化活性 NOS与细胞色素P-450都是以硫醇盐结合亚铁血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶,NOS的结构,NOS催化机理,认为NOS催化下合成NO的机理一般包括两个单氧化过程：首先，一分子氧及一分子NA

7、DPH与四氢叶酸反应生成中间产物N-羟基左旋精氨酸(NHA)；然后在黄素酶的参与下，NHA被继续氧化生成L-胍氨酸和一氧化氮,nNOS在心脏功能调节中的作用,nNOS不仅在神经细胞表达，也在骨骼肌细胞、心肌细胞等非神经细胞中表达。nNOS在细胞内的定位依赖于细胞骨架蛋白 Ca2+对nNOS的表达和活性调节有极其重要的作用。nNOS的转录受Ca2+调节，其活性亦受Ca2+调节,Ca2+对nNOS的表达和活性调节,nNOS源性NO的合成与电子由羧基端向氨基端转移有关，nNOS与Ca2+ 钙调蛋白的结合是触发这一电子转移的因素； 当心肌细胞内Ca2+浓度处于基础水平时，nNOS表现为无活性，而当Ca

8、2+浓度升高时，nNOS活性增高； 在神经细胞，nNOS的活性则受NMDA受体- Ca2+通道的调控； 心肌细胞肌纤维膜上的nNOS活性受浆膜Ca2+ 钙调蛋白依赖ATP酶调节,nNOS对心脏收缩功能的调节,nNOS源性NO对心肌收缩功能的调节是通过调控心肌细胞的钙负荷来实现的。 有文献报道，nNOS特异性抑制剂能增加心肌细胞Ca2+内流，提高细胞内Ca2+浓度，从而增强心肌细胞的基础收缩势； 由于nNOS在心肌细胞的分布主要在肌浆网，推测nNOS源性的NO以自分泌的形式通过调节钙离子流来调控心肌细胞的收缩功能,进一步的研究证明，nNOS对L型钙通道Ca2+内流起负反馈调节作用，细胞内Ca2+

9、浓度的增加将刺激nNOS合成NO，后者反过来抑制Ca2+内流。该负反馈调节机制可能对于维持生理状态下细胞内Ca2+浓度稳态，防止细胞内Ca2+浓度超载具有重要生理意义。 另外nNOS源性NO能提高Na+，K+-ATP酶活性，通过细胞内Na+水平和Na+, Ca2+交换体活性的改变间接影响细胞内钙负荷。,nNOS对心脏作用的靶点,兴奋收缩偶联相关蛋白是nNOS对心肌细胞钙调节的作用靶点 心肌细胞雷诺丁受体Ca2+释放通道也是nNOS作用的靶点 nNOS还可通过交感神经和迷走神经调节心脏收缩。（nNOS源性NO对中枢交感神经兴奋具有抑制作用）,NO对心血管系统活动的调控,cNOS生成的NO可能先与

10、含巯基的载体分子结合或形成硝基硫醇复合物，到达靶细胞后NO从载体释放并直接扩散至靶细胞内，进入靶细胞的NO与sGC中的Fe结合使之激活，产生cGMP而发挥其生物学效应。NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用。,NO对心血管系统活动的调控,NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用。在生理状态下，当血管受到血流冲击、灌注压突然升高时，血管内皮细胞感受到的增强的剪切力，开始大量合成NO。NO经扩散作用进入平滑肌细胞后开始发挥它的生理作用。NO作为平衡使者维持其器官血流量相对稳定，使血管具有自身调节作用。 NO能够降低全身平均动脉血压，控制全身各种血管床的静息张力，增

11、加局部血流，是血压的主要调节因子,NO与肿瘤,NO与血管形成密切相关。NOS的表达在肿瘤血管形成过程中有重要作用。肿瘤组织可通过自分泌细胞因子诱导iNOS的产生,从而调节NO的合成。NO可诱导内皮的分裂增生,促进肿瘤血管新生,调控肿瘤血流量,因而NO可能是肿瘤生长必要的血管形成开关,没有NO,肿瘤的生长将会因血供的缺乏而受到限制。,NO对肿瘤的作用,NO可在肿瘤早期通过介导DNA损伤来参与复杂的癌症形成过程,还可诱导血管生成和调节免疫系统来促进肿瘤的生长、侵袭和转移 进一步的研究表明NO在肿瘤微环境中的作用是多方面的,至少包括以下的几方面: (1)NO可促进血管内皮细胞分裂,诱导肿瘤形成。(2

12、)由内皮细胞和/或肿瘤细胞产生的内源性NO具有增加和/或维持小动脉血管扩张,降低白细胞/内皮细胞粘附,以及提高血管通透性的作用。,NO与细胞凋亡,在细胞信号转导过程中,NO通过开启或封闭细胞凋亡通路影响着细胞的存活,对多种细胞的凋亡具有双重影响,通常高浓度的NO会增强细胞凋亡,低浓度时则会延缓细胞凋亡。,NO诱导细胞凋亡的机制,诱导细胞DNA分子的损伤。NO可以抑制DNA分子的修复过程;增加具有遗传毒性的物质的产量 诱导线粒体膜通透性的改变并促进细胞凋亡 炎症过程中过多NO的产生可上调环氧化酶2(COX-2)的表达,诱导多种细胞凋亡 通过激活多种激酶来诱导凋亡,NO抑制细胞凋亡机制,通过环核苷

13、酸和神经酰胺来发挥抗凋亡作用。NO结合并激活鸟苷酸环化酶(GC)来产生cGMP,从而抑制多种细胞系的凋亡。 抑制线粒体的呼吸。生理浓度的NO能够通过膜去极化和钙离子的聚集而可逆地抑制线粒体膜通透性转运孔(PTP)的开放,显著的降低细胞色素C的释放,抑制细胞的凋亡。,NO与微生物,一氧化氮是微生物中重要的生物活性分子，在细菌生长、生物被膜形成、细胞保护以及耐药性等方面均能发挥重要作用。研究表明，微生物能够感受外源NO的作用，也可以通过自身的一氧化氮合酶(NOS)以及硝化和反硝化过程产生NO,最近几年，随着全基因组测序的快速发展，人们发现在某些革兰氏阳性菌如的基因组中存在与真核生物一氧化氮合酶基因

14、同源的序列。通过序列比对发现，原核生物NOS氧化酶(NOSoxy)只保留了其核心部分，丢失了还原酶区域(NOSred)和NOSoxy的N末端区域。生化研究表明，原核生物的NOS也具有与真核生物NOS类似的活性，能够将L-精氨酸转化成L-瓜氨酸并伴随NO的产生。因此，原核生物NOS和真核生物NOS具有结构和功能上的相似性,原核生物的NOS,内源性NO产生的另一种途径,硝化和反硝化过程中产生硝化和反硝化过程是革兰氏 阴性菌产生NO的主要途径。 NO是生化N循环反应如硝化和反硝化作用的自由中间体。硝化反应是指在有氧条件下，氨氮被硝化细菌氧化成为亚硝酸盐和硝酸盐的过程。它包括两个基本反应步骤：由亚硝酸

15、菌（又称氨氧化细菌)参与的将氨氮转化为亚硝酸盐的反应和硝酸菌参与的将亚硝酸盐转化为硝酸盐的反应。反硝化反应是在缺氧条件下，利用反硝化菌将硝化反应过程中产生的硝酸盐和亚硝酸盐还原成氮气的过程。在反硝化过程中，亚硝酸被亚硝酸还原酶还原成NO，然后进一步被NO还原酶还原成N2O,外源性NO,外源性NO对微生物的作用 外源高浓度的NO对微生物的作用主要是毒害作用。如巨噬细胞iNOS受到刺激产生大量的NO能抑制微生物DNA合成、线粒体三羧酸循环、电子传递等，从而发挥其抗微生物感染的作用,NO抗微生物感染的机制,目前普遍认为有两种途径。一方面，微生物体内许多酶的活性部位为4Fe-4S基团，NO与之形成铁-

16、二亚硝酰-二硫醇复合物而使酶的活性受到抑制，该途径目前已得到证实。NO抗微生物作用的另一机制是通过与氧自由基作用，即NO与超氧阴离子(O2-)作用生成过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)，ONOO-是强氧化剂，有明显的氧化和硝基化作用，ONOO-能与蛋白质上的酪氨酸残基结合可生成稳定的代谢物硝基酪氨酸，造成蛋白质活性丧失。由于ONOO-能够在细胞内自由扩散，故其细胞毒靶位极其广泛。,NO对微生物的作用,除了能够影响细菌生长，NO还能够调节细菌生物被膜形成，不同浓度NO对生物被膜形成的影响不同。生物被膜（biofilm）是细菌在生长过程中为适应生存环境的变化而附着于机体组织或生物材料表面而形成的一种

17、与浮游细胞相对应的生长方式。形成生物被膜后细菌毒力降低，但耐药性增强、感染时间延长，危害性增大。NO能够调控其在生物被膜和浮游生长状态间转变。当NO浓度超过30 ppm时将诱导N.europaea生物被膜的形成，而当NO浓度低于5ppm时，将导致生物被膜放散，运动性浮游状态细菌数量增加,内源性NO对微生物的作用,细菌内产生的NO能够缓解细菌的氧化压力。很多抗生素药物都会使细菌面临氧化压力，从而导致细菌死亡，Ivan Gusarov等的最新研究表明，细菌内产生的NO能够缓解细菌的氧化压力，同时还会帮助中和抗生素中的许多抗菌化合物，从而使细菌产生耐药性。其作用机制可能是通过NO对化合物的直接修饰使

18、其毒性降低或者是保护菌体抵抗由抗生素引起的活性氧簇（reactive oxygen species ROS）介导的毒性来完成的。根据这一性质，可以通过合成NOS抑制剂抑制NO的合成，削弱细菌的耐药性，提高现有抗生素的药效。,NO供体,一氧化氮(NO)供体是指在体内经酶促反应或非酶促反应释放NO的一类化合物 NO供体大致包括有机硝酸酯,如硝酸甘油(NG)、硝酸异山梨酯(ISDN)和尼可地尔等,亚硝酸酯、无机硝酸盐、亚硝酸盐,以及它们分别与其他分子结合的耦联化合物,如NO-阿司匹林(NCX-4061)等。,有机硝酸酯类NO供体,有机硝酸酯类NO供体药物得到了广泛的研究,诞生了一系列潜在药物。它们具

19、有解热镇痛、抗炎、抗心血管疾病、抗癌、抗微生物感染等多方面的作用,比母体药物有更好的耐受性和安全性。 在治疗威胁到人类生命健康安全的重大疾病的领域,出现了一些极具应用前景的NO供体药物,传统的有机硝酸酯类药物,有机硝酸酯类是最早发现的NO供体药物,它们是经典的血管扩张剂,包括有机硝酸酯类、有机亚硝酸酯类以及亚硝酸硫醇酯类,其中研究最多的是有机硝酸酯类。早期问世的有机硝酸酯类药物包括硝酸甘油、丁四硝酯和硝酸异山梨醇酯等,如图所示。这些药物经口腔吸收速度快,抗心绞痛明显。现开发的单硝酸异山梨酯水溶性增大,不易穿透血脑屏障,克服了硝酸异山梨酯引起头痛的不良反应,硝酸酯类药物,硝酸酯类药物对血管的舒张

20、作用一般认为,硝酸酯类药物舒张血管的机制是硝酸酯与血管平滑肌细胞内巯基(-SH)结合,产生EDRF(NO),激活鸟苷酸环化酶(GC),使环鸟苷单磷酸(cGMP)生成增加,后者又促使平滑肌钙离子(Ca2+)内流减少,血管平滑肌松弛,从而使血管扩张,当SH基减少,NO或其中间存贮体亚硝酸盐减少,从而产生血管舒张作用的耐受性,亚硝酸盐类药物,亚硝酸盐类药物在肝脏和心脏的缺血-再灌注中有明显的保护作用,其效应通过NO实现。 NO在体内有3种不同的状态存在:不带电基团(NO),氧化状态(NO-)和还原状态(NO+)。近来,人们开始重新关注在生理状态下主要以亚硝酸(HNO)形式存在的有特异的心血管调节功能的NO,有机硝酸酯类NO供体型循环系统药物,NO具有抗血栓