15 第十五章 基因工程与分子生物学常用技术

1、分子生物学技术现已广泛渗透到生命科学和医学等多个学科中，尤其推动了基因工程的发展。 对疾病的发病机制、诊断及药物生产等领域取得了令人瞩目的成就，对医学的发展起着巨大的推动作用。,第一节 基因工程与基因重组,(Genetic Engineering and Genetic recombination),一、基因工程的基本概念,不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。,将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。,(一)工具酶,1.限制性核酸内切酶 (1) 能够切割DNA中磷酸二酯键的酶称核

2、酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。,(2)命名,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,(3)识别特征,5GAATTC3 3CTTAAG5,限制性内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征。,不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：,产生3 突出粘性末端：以EcoR为例： 5GAATTC3 5G AATTC3 3CTTAAG5 3CTTAA G5 产生5 突出粘性末端：以Pst为例： 5CTGCAG3 5CTGCA G3 3GACGTC5 3 G ACGTC5 产生平末端：Nru

3、为例： 5TCGCGA3 5TCG CGA3 3AGCGCT5 3AGC GCT5,(4)切割位点,2.DNA聚合酶,(1)基因工程主要应用E.coli DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等。,(2)主要用途： 利用5/3/聚合活性，合成DNA第二条链； 对DNA的3/端进行填补或末端标记； E.coli DNA-pol用于缺口平移，制作探针； T4 DNA聚合酶可用于DNA序列测定； Taq DNA聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)。,3.DNA连接酶,使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。,4.逆转录酶,(1)用于真核mRNA逆转录，构建cDNA文库。 (2)用于进行3

4、/端填补和标记，制备DNA探针。 (3)用于DNA序列测定。,5.多核苷酸激酶 (1)用于放射性标记DNA链的5/端。 (2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。 6.碱性磷酸酶 此酶防止载体的自身连接。 7.末端脱氧核苷酸转移酶 能催化单核苷酸转移到DNA的3/-端羟基上。,(二)载体,1. 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。,2. 载体的选择标准,能自主复制。 易进入宿主细胞。 具有多克隆位点。 易从宿主细胞中分离纯化。 有易被识别和筛选的标志。,质粒 噬菌体 粘粒 病毒,3.常用载体,质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌

5、或细胞共存的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。 通常质粒的大小为2300kb。 一般只能容纳10kb的外源DNA片断。,(1)质粒(plasmid),(2)噬菌体(bacteriophage，phage),噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。,噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。,具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。,(3)粘粒(cosmid),粘粒本身约4 6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。,粘粒是将噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。,(4)病毒,病毒载体更多地用于真

6、核表达系统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。,二、重组DNA技术的基本原理和过程,基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采用的技术即重组DNA技术，故又称为分子克隆技术或基因工程技术。,制备目的基因和相关载体； 将目的基因和载体进行连接； 将重组的DNA导入受体细胞； DNA重组体的筛选和鉴定； DNA重组体的扩增、表达。,基本步骤,(一)目的基因的制备,1. 制备基因组DNA文库 (genomic library) 将基因组DNA酶切成片段，再与载体分子拼接成重组DNA，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体称基因组文库。

7、,2. 制备cDNA文库 (cDNA library) 将mRNA逆转录合成cDNA ，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNA文库。,3.聚合酶链式反应(PCR),如已知目的基因序列，则可采用PCR从基因组DNA中获得目的基因，也可以采用逆转录PCR (RT-PCR) 直接从mRNA获得特定基因的cDNA。,4化学合成,如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码子推导出DNA的碱基序列，然后合成该段DNA序列。,(二)目的基因与载体的连接,1粘性末端连接 2同聚物加尾连接 3平末端连接 4人工接头连接,将目的基因插入载体，用DNA连接酶连接双链DNA

8、粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方法主要有以下四种：,(三)将外源DNA导入宿主细胞,常用的方法有以下两种：,1.转化(transformation) 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。,2.感染(infection) 感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。,1.遗传学方法 针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(ampr、tetr 、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。 2.分子杂交方法 利用32P标记的探针与重组DNA或克隆DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。 3.免疫学方法 利用特异性抗体与

9、目的基因表达产物特异结合的方法筛选。,(四)目的基因的筛选和鉴定,(五)克隆基因的表达,利用重组DNA技术所获得目的基因或DNA序列，可实现在受体细胞中的表达，即产生mRNA或蛋白质产物。,(六)重组DNA技术操作过程总结归纳,2. 特点 针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。,三、基因诊断和基因治疗,1.基因诊断是指利用分子生物学技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,(一)基因诊断(gene diagnosis),3. 应用,遗传性疾病 肿瘤 感染性疾病 遗传易感性疾病 器官移植配型 法医学中个体识别、亲子鉴定,1. 基因治疗是指以正常基因矫正、替代

10、缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。 2. 狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。 3. 广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。,(二)基因治疗(gene therapy),5.基因治疗的基本程序,4.基因治疗的基本策略,(The Technology and Application in Molecular Biology),第二节 分子生物学 技术及其应用,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 是指利用DNA复性原理，把不同

11、来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。,一、核酸分子杂交技术,(一)探针(probe),2.理想探针的特点 (1) 带有标记的示踪物，便于检测、鉴定； (2) 应是单链； (3) 具有高度特异性； (4) 探针长度一般为数十至数千个碱基; (5) 具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。,1. 探针是一段与被测的核苷酸序列(靶基因序列)互补的带有标记的核苷酸片段。,(二)核酸分子杂交的基本方法,Southern印迹杂交 (1) 指将经酶切和电泳分离的待测DNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的DNA探针杂交。 (2) 可用于分子克隆、遗传病

12、诊断、法医鉴定、肿瘤研究和器官移植等方面。,2. Northern印迹杂交 (1) 指将经电泳分离后的待测RNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。 (2) 主要用于检测各种基因转录产物，主要是mRNA 。,3.斑点及狭缝印迹杂交 (1) 指将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。 (2) 主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。,4.原位杂交 (1) 指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 (2) 该方法不需从组织或细胞中

13、提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。,二、聚合酶链反应,(一)PCR的基本原理,1. PCR有三个反应步骤,DNA的变性 DNA与引物的退火(复性) 引物的延伸。,2.变性复性延伸这三个步骤为一个循环，每次循环的产物作为下个循环的模板，如此循环多次， 则DNA成指数扩增。,PCR反应体系： 1. 引物 是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。 2. 酶浓度酶催化的PCR反应的Taq DNA聚合酶量约需2.5U。 3. dNTP的质量dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易

14、变性失去生物学活性。 4. 模板核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。,(二)PCR的基本反应,1可分析基因转录产物；构建cDNA文库；克隆特异cDNA；合成cDNA探针。 2可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。 3用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。 4应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。 5根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。,(三)PCR的应用,三、核酸的序列分析,(一)DNA链末端合成终止法(Sange

15、r法),采用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子发出不同波长荧光，采集荧光信号，确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,(二)DNA自动测序,四、基因文库,基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。包括基因组DNA文库和cDNA文库。,五、生物芯片技术,(一)基因芯片(gene chip),是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。包括DNA芯片(DNA chip) 和cDNA芯片 (cDNA chip) 。,是将蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，可特异性与待测样品中的靶蛋白反应，再进行定性或定量分析的技术。,(二)蛋白质芯片(protein chip),(三)生