第九讲蛋白质相互作用-2011

1、宋婀莉 副研究员 中国科学院生物物理研究所 songali,蛋白质相互作用研究方法 蛋白质相互作用与疾病,AKT Signaling Pathway,蛋白质相互作用,cdc25 and chk1 Regulatory Pathway in response to DNA damage,Regulation of BAD phosphorylation,(Source: BioC),Far Western印迹 蛋白微阵列 (Protein Microarray) 荧光共振能量转移 ( FRET , Flurorescence Resonance Energy Transfer) BIA-MS/M

2、S (Biomolecular Interaction Analysis based on Surface Plasmon Resonance) 等温滴定量热技术(ITC, Isothermal Titration Calorimetry) 蛋白复合体分析( Direct protein complex analysis ) 亲和纯化 (Affinity Purification) 定向肽库 (Oriented Peptide Library) 定向肽库蛋白芯片 ( Oriented Peptide Array Library ),蛋白质相互作用研究方法,Protein-protein Int

3、eraction Analysis,Far Western印迹,蛋白微阵列 （protein microarray）,荧光共振能量转移 FRET (Flurorescence Resonance Energy Transfer),Biacore-MS/MS,表面离子共振技术 (SPR),等温滴定量热技术 (ITC, Isothermal Titration Calorimetry),Protein Complex Analysis,Direct protein complex analysis Affinity purification,Direct protein complex analy

4、sis,Purification: based on biological activities Separation: 2DE, LC, centrifugation, flow cytometry Identification: MS Examples: vesicle post-synaptic density (PSD) receptor signaling complex ,亲和纯化（ affinity purification ）,纯化： 抗体 Epitope-tag：flag, myc, HA, V5, GST 核酸 In vitro pull-down In vivo immu

5、noprecipitation In vivo TAP (Tandem Affinity Purification),Mammalian TAP-MS,LAP-MS (Localization and Affinity Purification),Protein-peptide Interaction Analysis,定向肽库 （oriented peptide library）,定向肽 oriented peptide,pY,A,X,定向肽库蛋白芯片 （ Oriented Peptide Array Library ）,Oriented Peptide Library,Far Wester

6、n印迹 蛋白微阵列 (Protein Microarray) 荧光共振能量转移 ( FRET , Flurorescence Resonance Energy Transfer) BIA-MS/MS (Biomolecular Interaction Analysis based on Surface Plasmon Resonance) 等温滴定量热技术(ITC, Isothermal Titration Calorimetry) 蛋白复合体分析( Direct protein complex analysis ) 亲和纯化 (Affinity Purification) 定向肽库 (Ori

7、ented Peptide Library) 定向肽库蛋白芯片 ( Oriented Peptide Array Library ),蛋白质相互作用研究方法,蛋白质相互作用与疾病,疾病的起因,异常相互作用 正常相互作用的缺失 非正常相互作用的出现 会引起细胞正常生理状态发生紊乱，最终导致机体的疾病。,蛋白质相互作用由相互作用结构域介导,绝大多数蛋白质由单个或多个结构域组成,RasGAP,相互作用结构域,催化结构域,相互作用结构域与识别模体结合,RasGAP,p-Tyr,PXXP RXXK,p-Tyr,模体（motif）,SH2结构域与pY模体的结合,PDZ结构域与C末端模体的结合,信号通路中的

8、蛋白相互作用结构域,蛋白质相互作用结构域与疾病,异常相互作用 正常相互作用的缺失 非正常相互作用的出现 会引起细胞正常生理状态发生紊乱，最终导致机体的疾病。 相互作用结构域与结合模体间相互作用的改变往往是相互作用异常的根本原因。,常见结构域与疾病,SH2结构域与疾病 WW结构域与疾病 PDZ结构域与疾病 多结构域参与的疾病,SH2结构域,由约100个氨基酸残基组成 特异性识别磷酸化的酪氨酸残基（pY）及其C端的36个氨基酸残基 广泛分布于酪氨酸激酶、磷酸酶、磷酯酶、信号接头蛋白和转录因子等多种蛋白，参与调控多条信号通路,SH2结构域与肿瘤,酪氨酸激酶,正常情况下，活性是受特定的分子内或分子外调

9、控机制调节 若调控机制被破坏会造成激酶活性失控，可能最终导致肿瘤 SH2结构域和SH2识别模体是绝大多数酪氨酸激酶蛋白重要的结构组成。,Src酪氨酸激酶家族蛋白分子内活性调控机制,Clues,The kinase activity of Src is negatively regulated by phosphorylation of tyr527 at the C-terminal region of Src,The inhibitory effects of tyr527 phosphorylation require the N-terminal SH2 domain,Predictio

10、n model,The SH2 domain and the tyr phosphorylated tail act co-operatively to repress kinase activity,Is Src SH2 domain binds to the tyrosine phosphorylated Src tail? What is the function of the interaction?,Is this indeed the case?,Prediction model,Is Src SH2 domain binds to the tyrosine phosphoryla

11、ted Src tail ?,Method: GST pull-down: Src tail peptide pull-down GST-Src SH2,The Src SH2 domain binds specifically to the tyrosine phosphorylated Src tail,Results,Oncogene, 1993, 8, 1119-26,Specific binding of SH2 domain to the C-terminal tail requires,Dephosphorylation of tyr527 markedly diminished

12、 the binding,Oncogene, 1993, 8, 1119-26,Specific binding of SH2 domain to the C-terminal tail requires both phosphorylation of tyr527,Specific binding of SH2 domain to the C-terminal tail requires both phosphorylation of tyr527 and the surrounding peptide sequences,The Src SH2 domain and tail region

13、 in regulation of Src kinase activity,Incubation of Src, immunoprecipitated in its inactive state from NIH3T3 cells over-expressing c-src, with The samples were subjected to in vitro kinase reaction with 32P-ATP and substrates. The products were analyzed by SDS-PAGE and autoradiography.,Oncogene, 19

14、93, 8, 1119-26,Positioning of the SH2 Domain and SH2 Domain-Dependent Regulation of c-Abl,c-Abl酪氨酸激酶蛋白活性调节研究,Cell, Vol.112, 845-57, March 21, 2003,SH2结构域与Noonan综合症,Noonan综合症(Noonan syndrome，NS) 一种多态型常染色体显性遗传病 主要症状是面部变形、身材矮小、脖子蹼连和心脏缺陷。,PTPN11 mutations in Noonan syndrome,Nature Genetics 29, 465 - 468

15、 (2001),SHP-2 蛋白,PTPN11 基因,Nature Genetics 29, 465 - 468 (2001),SHP-2非活性结构,突变,活性改变,Nature Genetics 34, 148 - 150 (2003),SH2结构域与生长激素不敏感综合症,生长激素不敏感综合症 （Growth Hormone Insensitivity Syndrome, GHIS） 绝大多数GHIS病人是由于生长激素受体胞外结合生长激素的结构域发生突变或缺失所致 当生长激素受体正常时，也可能由于生长激素受体下游信号转导蛋白的缺陷所致 STAT5b蛋白突变 STAT是生长激素信号转导通路中的

16、一种蛋白，在生长激素诱导的IGF-I活化以及生长、发育过程中发挥重要作用。在一些GHIS病人中发现STAT5b基因存在错义突变，只编码半个SH2结构域，导致不能正常结合和募集下游蛋白到磷酸化的生长激素受体并进行受体的二聚化。,SH2结构域与X-连锁淋巴组织增生症,X-连锁淋巴组织增生症 （X-linked lymphoproliferative disease，XLP） XLP是由一种在T细胞中表达的SH2D1A基因的突变所致。 SH2D1A基因编码SAP蛋白，一个小接头蛋白，只含有一个功能性的结构域SH2，主要在引导免疫反应发生和发展的信号通路中发挥重要作用。其SH2结构域与SLAM结合，阻

17、断SHP-2磷酸酶与SLAM的结合，从而抑制T细胞的信号转导。因此，SH2D1A基因突变导致的SAP SH2结构域功能的异常与XLP的发病有着密切的关系。,SH2结构域与X-连锁低丙球蛋白血症,X-连锁低丙球蛋白血症 （X-linked agammaglobulinaemia，XLA） BTK（bruton tyrosine kinase）突变 BTK是Tec蛋白酪氨酸激酶蛋白家族的成员之一，由5种结构域PH、TH、SH3、SH2和激酶结构域组成 其SH2结构域与BLNK结合，对于磷脂酶C-的活化非常重要，若其突变导致XLA。 另外，发生在BTK蛋白的所有5种结构域上的突变都可引起XLA,休息

18、，休息一下！,WW结构域,由约38-40个氨基酸残基组成，含两个高度保守的色氨酸残基（W） 特异性地与含有聚脯氨酸残基的保守序列结合，如：PPxY、PPPR、PPRP、PPLP、PPPPP和（pS/pT）P等 介导蛋白质之间的相互作用，参与蛋白降解、病毒芽生、RNA剪切、转录共激活以及有丝分裂的调节等生物学过程,WW结构域与Liddles 综合症,1963年由Liddle及其同事发现 常染色体显性遗传病 盐敏感，高血压综合症,发病机制,上皮钠离子通道（epithelial Na+ channel, ENaC）的或亚基羧基端区域缺失或发生点突变，导致肾远曲小管钠离子重吸收增加。,上皮钠离子通道E

19、NaC,功能：负责钠离子的跨膜运输 分布：肾小管、结肠、肺和唾液腺等组织特化的上皮细胞腔面的质膜中,结构：,PY motif,ENaC和Nedd4的结合,Nedd4: 一种泛素连接酶（E3）,使需被降解的蛋白连接上泛素链，通过泛素蛋白酶体途径降解。,PY motif,Nedd4,Liddles 综合症,突变或缺失,相互作用被打断,ENaC不能正常泛素化和降解,ENaC在质膜上的半寿期延长、活性增加,钠离子重吸收的增加,引起高血压Liddles综合症,Liddles 综合症发病机制的研究,Liddle Disease Caused by a Missense Mutation 1780-4,Mi

20、ssense Mutation of -Subunit of ENaC Gene Y618H,Pedigree of a family with Liddles disease,Increase in amiloride-sensitive current expressed by R564stop and Y618H mutant in the oocytes,Identification of the partner(s) of mutation region of /-subunits of ENaC in Liddles syndrome patients,What is the me

21、chanism of the Liddles syndrome? And how to identify it?,Isolation of rNedd4 by yeast two-hybrid,Bait: the C-terminal proline-rich region of -rENaC Library: rat lung cDNA library Results:,rNedd4,The EMBO Journal vol.15 no.10 pp.2371-2380, 1996,yeast two-hybrid,Identification of the region in rNedd4

22、responsible for binding to /r ENaC,In yeast two-hybrid system,The EMBO Journal vol.15 no.10 pp.2371-2380, 1996,In vitro: GST-pull down,The EMBO Journal vol.15 no.10 pp.2371-2380, 1996,To test whether PY motif mediates the interaction? Competition experiments with P2-peptide,Identification of the key

23、 sites in PY motif,Point mutation analysis in yeast two-hybrid system,The EMBO Journal vol.15 no.10 pp.2371-2380, 1996,What about the or rNedd4?,Yeast two-hybrid system,Competition experiments,In vitro: GST-pull down,The EMBO Journal vol.15 no.10 pp.2371-2380, 1996,Amiloride-sensitive Na+ current fo

24、r ENaC co-expressed in oocytes with Nedd4,Biochem. J. (2000) 345, 503-509,Down-regulation of ENaC activity by Nedd4,生理,病理,Na+ current in oocytes expressing ENaC with Nedd4,Na+ current in oocytes coexpressing Nedd4 or control plasmid with WT or R566X/Y620A mutant,Vol. 273, No. 45, Issue of November 6

25、, pp. 3001230017, 1998,A postulated model for ENaC-Nedd4 interaction and implications for Liddles syndrome,Normal,Liddles syndrome,The EMBO Journal vol.15 no.10 pp.2371-2380, 1996,如何治疗Liddles 综合症？,突变或缺失,ENaC被泛素化和降解,设想：构建一个人工融合蛋白 E3,由70-90个氨基酸残基组成 一般特异地识别配体蛋白C末端的4个氨基酸残基 与多种生物功能有关，如细胞信号转导，神经递质运输，蛋白亚细胞

26、定位及细胞连接的形成等,PDZ结构域,PDZ结构域与帕金森综合症,最常见的神经退行性疾病之一。在65岁以上的人群中发病率为12%，随着年龄增长发病率增高 PD病人行为紊乱表现为动作迟缓、僵硬和振颤。他们的脑部病理症状是黑质致密部多巴胺能神经元细胞的大量丧失，同时伴随着纹状体多巴胺水平的骤减 环境因素和遗传因素,Parkin（E3）蛋白突变 引起常染色体隐性、青少年启始型PD,K.K. Dev et al. / Neuropharmacology 45 (2003) 113,PDZ motif,一种缺失突变,Parkin的C末端结合CASK,GST pull-down 脑突触体 用一系列的PDZ

27、蛋白抗体进行western-blot检测 Parkin的C末端与CASK特异性地结合,JBC,Vol. 277, No. 1, January 4, pp. 486491, 2002,Colocalization of parkin and CASK,Western-blot Parkin Co-localizes with CASK in PSD and Lipid Rafts,PSD,low density lipid rafts,JBC,Vol. 277, No. 1, January 4, pp. 486491, 2002,E16 大鼠皮层原代培养；免疫组化 Parkin和CASK在皮

28、层神经元中共定位,JBC,Vol. 277, No. 1, January 4, pp. 486491, 2002,In vivo interaction Coimmunoprecipitation brain synaptosomes parkin interacts with CASK in vivo,JBC,Vol. 277, No. 1, January 4, pp. 486491, 2002,Is Not a Substrate for Parkin-mediated Ubiquitination？,in vitro ubiquitination assay CASK it is n

29、ot ubiquitinated by parkin May involve trafficking the E3 Ub-ligase to the appropriate subcellular compartments,JBC,Vol. 277, No. 1, January 4, pp. 486491, 2002,parkin募集多种配体蛋白形成的蛋白质复合体,多结构域参与的疾病,慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukaemia, CML） 一种恶性骨髓增生性疾病 标志分子是费城染色体，表达Bcr-Ab1融合蛋白,Bcr-Ab1具有组成性的酪氨酸激酶活性 Bcr的嵌入，使Abl激酶结构域上游含有多个相互作用结构域,NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 5 | MARCH 2005 | 172-83,Bcr-Abl蛋白参与的CML相关信号通路图,NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 5 | MARCH 2005 | 172-83,SH2,SH3,SH3 motif,疾病相关蛋白质相互作用研究,大规模蛋白质相互作用研究,酵母,线虫,果蝇,人类蛋白质相互作用网络图,A human pr