色谱绪论10.ppt

1、第十七章 色谱分析法概论,1、概述.色谱法的特点、分类和作用 2、色谱过程与术语 3 、色谱分离的塔板理论 4、色谱分离的速率理论 5、色谱分离的基本分离方程 6、基本类型色谱法的分离机理 7、色谱技术发展趋势,一、色谱法的作用、分类和特点,1 色谱法的作用 色谱法是一种混合物分离技术。 以柱色谱为例，柱中装的填料固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配平衡过程。,当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中各组分与固定相之间作用力的大小、强弱不同，随着流动相的

2、移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序从色谱柱中流出。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。 混合物中的各组分同时进入层析柱顶端，但依次顺序从柱的另一端流出。,色谱过程,2 色谱法分类,按流动相的状态不同分为三类： (1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 (2) 液相色谱：流动相为液体。 (3) 超临界流体色谱，以超临界CO2为流动相。,3 色谱法特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2） 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 （3） 分析速度快 几分钟

3、或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 不足之处：被分离组分的定性较为困难。,2、色谱流出曲线与术语,当组分从色谱柱流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的曲线称为色谱流出曲线。 当实现良好分离时，每个色谱峰代表一个化合物成分，色谱峰的面积与该化合物的含量成正比。在理想情况之下，色谱峰形状是正态分布曲线。,1.色谱流出曲线参数 （1）基线 流动相通过检测器时，检测到的信号即为基线。 在理想情况之下，色谱峰形状是正态分布曲线。色谱峰的形状用下述参数描述。 （2）峰高

4、(h) 色谱峰顶到基线的垂直距离。,（3）三种峰宽参数,标准偏差()： 将色谱峰看作为正态分布曲线，是正态分布曲线两拐点距离之半，即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 W1/2 =2.354 ，在谱图上易读准确 峰底宽(Wb)：在正态分布曲线两拐点处作切线，切线与基线交点之间的宽度，Wb=4 ，在谱图上不易读准确,2.保留值 表示各组分在色谱柱中的滞留状态，是主要的色谱定性参数。,保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值（即色谱峰顶值）的时间； 死时间（t0）：不与固定相作用的组分（如空气）的保留时间； 调整保留时间（tR ）：tR= tRt

5、0,（1）用时间表示的保留值,（2）用流动相体积表示的保留值,保留体积VR：组分从进样到柱后出现浓度极大值时流过的流动相体积。 VR = tRF0；F0为柱出口处的流动相流量，单位：m L / min。 死体积V0：由进样器至检测器的流路中，未被固定相占有的空隙体积，包括：进样器至色谱柱入口导管的体积、色谱柱内固定相的孔隙及颗粒间隙体积、色谱柱出口至检测器的体积。与此相应，死时间t0表示流动相充满该死体积所需要的时间。 V0 = t0 F0； 调整保留体积VR： V R = VR V0,（3） Kovats 保留指数Ix,人为规定具有n个碳原子正构烷烃的Kovats 保留指数为100n。在同一

6、根色谱柱上，测出与被测组分保留时间紧相邻的两个正构烷烃的保留时间，按下式计算Kovats 保留指数Ix。即以两个保留时间紧相邻的正构烷烃来标定该组分。,Kovats 保留指数Ix只与固定相种类有关， Ix 越大，表明固定相对该被分析成分保持作用越大。求出未知物的保留指数Ix ，与文献值对照，可实现未知物的定性。,(见孙毓庆编.分析化学，p439),例：在同一根色谱柱上测出：正庚烷，正辛烷和未知物的调整保留时间分别为14.08s，25.11s和16.32s，试计算它们的保留指数I。,解：由定义可知： I庚=1007=700 I辛=1008=800 由求出的保留指数与文献保留指数对照可知未知物为甲

7、苯。,3.分配系数K和容量因子k,(1)分配系数K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数K越大，被分析成分所受到的固定相的滞留作用就越强，从而出峰越慢； K = 0时，被分析成分不被固定相保留，最先流出。,K取决于组分、固定相及流动相三者的热力学性质，即随柱温及压力而变化；,(2)分配比 （partition ratio）k,分配比指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比，也称容量因子(capacity factor)；容量因子越大，保留

8、时间越长。,式中： ms 、mm分别为被分析组分在两相间分配达到平衡时的质量； Vm为柱内流动相占据的体积，即柱内固定相的孔隙及颗粒间的空隙体积； VS为柱内固定相体积。对不同类型色谱柱， VS的含义不同。对于气-液色谱柱，VS为固定液体积；对于气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量； Vm/Vs ， 填充柱635；毛细管柱501500。 分配比与组分、流动相及固定相的热力学性质有关，并与色谱柱的两相体积比有关。,4.容量因子k和调整保留时间的关系,色谱过程可认为是稳态过程，在色谱带前移的时间过程中，该组分所有分子分布在流动相中的量的比例不变；在整个色谱层析过程中，每个分子分布在流动相中的时间比

9、例不变。 流动相在柱内的线速度设为Uo；组分分子在柱内的线速度设为Usamp，则： Usamp Uo色谱过程中组分分子分布在流动相中的时间比例； 对于该组分的大量分子而言，从统计角度看，组分分子分布在流动相中的时间比例=色谱过程中，组分分子分布在流动相中的量的比例。因此推得：,式中，Vm和Vs的意义见前述，二者都为定值。因此，分配系数不同的各组分具有不同的保留值，在色谱图上有不同位置的色谱峰。,由,得： tR = t0(1+k) 或： tR = t0k 由上式得：分配比k等于该组分的调整保留时间与死时间的比值：,当忽略柱前后的死体积时： 色谱柱内流动相体积Vm=色谱柱系统死体积V0 若载气流量

10、F0恒定，且Vm = V0时，可得出：,色谱分离过程原理小结,某成分从进样到流出分离柱，所用总时间是tR，而流动相从进样口到流出分离柱需时t0，则有： tR = t0(1+k)=t0+kt0， 其中：,kt0是该成分被固定相“拘留”后，累计“扣留”于固定相中的时间； t0是该成分被固定相“释放”后，累计存在于流动相中的时间； 注意： （1）色谱过程中，新鲜流动相始终不停地从柱的入口流向出口。 （2）被分析成分只有被“释放”进入流动相，才能随着流动相流向出口，它存在于流动相中的累计时间必须达到t0，它才能随着流动相流到出口。当它被固定相“拘留”时，它是动不了的。这里的“拘留”与“释放”是微观的吸

11、附与解吸过程的比拟。,5. 分离参数 ：（1）分离度,R=0.75：部分重叠； R=1.0：相邻两峰基本分离； R=1.5：完全分离。,分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和一半的比值。,（2） 相对保留值,相对保留值与被分析成分及固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关。 相对保留值表示固定相对这两种组分的选择性，又称选择因子。如果两组分的K或k值相等，则=1，两组分的色谱峰必将重合而无法分离。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数K或不同的容量因子k是色谱分离的先决条件。,例：用一根固定相的体积为0.148mL，流动相的体积为1.26mL

12、的色谱柱分离A,B两个组分，它们的保留时间分别为14.4min，15.4min，不被保留组分的保留时间为4.2min，试计算：（1）各组分容量因子（2）分配系数（3）A、B两组分选择因子,解： (1) k=(tr-t0)/t0 kA=(14.4min-4.2min)/4.2min=2.43 kB=(15.4min-4.2min)/4.2min=2.67 K=kVm/Vs KA=kAVm/Vs=2.431.26mL/0.148mL=20.7 KB=kBVm/Vs=2.671.26mL/0.148mL=22.7 (3) =KB/KA=22.7/20.7=1.10,6. 吸附等温线及其与色谱峰的对称

13、性,（1）吸附等温线：被分析成分在固定相中的浓度Cs与其在流动相中的浓度之间的关系。理想状态下二者成线性关系。,吸附等温线向上凸起，表示吸附剂的高度活性中心被组分分子占据后，吸附能力趋于饱和而下降。洗脱峰拖尾或前伸，表示被吸附剂高度活性中心吸附的溶质相对难洗脱。 实际遇到的主要是拖尾峰，前伸峰的场合较少遇见。,（2）对称因子T：描述峰的不对称性,T=0.951.05：对称峰 T1.05：拖尾峰,(1) 在每一个平衡过程间隔内，组分在固定相和流动相之间的平衡可以迅速达到；这一小段间隔的柱长称为理论塔板高度。 (2) 流动相脉动进入，每次进入一个板体积； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (

14、4) 各理论塔板上的分配系数相同。,1.塔板理论假设 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。假设：,三、色谱分离的塔板理论,单个组分流经塔板模型色谱柱的运动过程分析 设色谱柱由六块塔板构成，某组分的分配比为1。开始时，设有单位质量的该组分加到1号塔板上，分配达平衡后，1号塔板的固定相及流动相中各分配0.5质量单位的组分。当下一个板体积的流动相以脉动形式加入1号塔板时，就将原流动相中的0.5质量单位的组分顶入2号塔板的流动相中。然后， 1号塔板的固定相中留下的0.5质量单位组分重新在其流动相及固定相中分配，各为0.25质量单

15、位。同样，进入2号塔板的流动相的0.5质量单位组分也在其流动相及固定相中进行分配，各为0.25质量单位。此后，每当一个新的板体积流动相进入色谱柱时，上述过程就重复一次，见下图。按照塔板理论，单个组分流经塔板模型后，其色谱峰形状理论上是正态分布的平滑曲线。,按照塔板理论，混合组分流经塔板模型后，依据各组分与固定相之间保留作用的不同，而先后流出色谱柱。分配系数K小的组分先流出色谱柱。,2.理论塔板数和理论塔板高度 色谱柱长L； 虚拟的塔板间距离（理论塔板高度）H：由于在理想情况之下，色谱峰形状是正态分布曲线，标准差是峰宽的评价，反映柱分离效能的高低，越小，峰形越尖锐，表示分离能力越好，柱效越高，因

16、此，定义理论塔板高度H为单位柱长的方差： H = 2/L 色谱柱的理论塔板数n：n理论 = L / H 将峰宽用时间表示，理论塔板数为：,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。塔板数n称为柱效参数。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。通常采用指定的标准物质表示色谱柱的柱效。,3.有效塔板数和有效塔板高度,组分在柱内参与分配的有效时间是调整保留时间。为此，引入有效塔板数和有效塔板高度：,例：用一根柱长为1m的色谱柱分离含有A，B，C，D四个组分的混合物，它们的保留时间tR分别为6.4min, 14.4min,15.4min,20.7min,其峰底宽Wb分别0.45min, 1.07min, 1

17、.16min,1.45min。试计算各谱峰的理论塔数。,解：,4.色谱分离的塔板理论小结,塔板理论将色谱柱比拟看作为含有n 个塔板、每个塔板高度为H 的分馏塔，将色谱过程比拟为分馏过程。 当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大，塔板高度 H 越小，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 塔板理论研究了色谱过程的热力学影响因素，但不能解释同一色谱柱同一物质在同一载气的不同流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效（如塔板高度H）的因素及提高柱效的途径。,四、 速率理论

18、（影响柱效的因素）,荷兰学者Van Deemter等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理论的概念，把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系，即速率方程： H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度; u：色谱柱中流动相的线速度(cm/s)，u=L/t0; L: 色谱柱长 如可减小A、B、C 三项，则理论塔板高度H减小，柱效提高。,1. A涡流扩散项,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒dp，填充得越均匀， A，H，柱效n，涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，A=0。,样品中

19、各组分同时加到层析柱入口端，但组分中的各分子随流动相在柱内流过的路径不同，耽搁的时间也不同，因此不能同时从层析柱流出，导致色谱峰变宽。,3. B/u 纵向扩散项（分子扩散项）。由于浓度梯度，试样组分谱带随着流动相前移时，会向谱带前后扩散，导致色谱峰变宽, ：自由扩散程度因子，也称为弯曲因子。空心毛细管中组分分子可以自由扩散，扩散程度最大,=1；填充柱色谱中组分分子的自由扩散受到固定相颗粒的障碍，扩散程度减小, 1。 Dg：试样组分分子在流动相中的扩散系数（cm2s-1）。 (1) 扩散系数Dg与组分及载气的性质有关： Dg (M载气)-1/2 ； M载气，B值。 Dg (M组分)-1 (2)

20、分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，分子扩散; (3)扩散系数Dg随柱温Tc升高而增加, Tc ,分子扩散 。,B = 2 Dg,4. C u 传质阻抗项,溶质随流动相进入色谱柱，由于分子扩散作用，溶质经流动相与固定相的界面进入固定相被吸附或吸收，在两相中达到平衡。载气处于连续流动状态，未能进入固定相的溶质分子被载气推着前进，发生分子超前，有些溶质在固定相中未能及时解析进入流动相，发生分子滞后，由此导致谱带变宽。 C =Cg+Cl C: 传质阻抗系数 Cg : 气相传质阻抗系数 Cl : 液相传质阻抗系数,q为由固定相颗粒形状及孔结构决定的参数。 k为容量因子； DL为溶质在固定液中的扩散系

21、数；df是固定液膜的厚度。,气相色谱中，载气对溶质分子的传质阻力很小，可或略不计，仅需考虑固定液对溶质分子的液相传质阻力系数CL ，即：,减小L的措施： (1) 降低固定液液膜厚度并且液膜要均匀；若膜厚，扩散导致滞后；但不能太薄，否则包不住载体。 (2) DL越大越好，增加柱温是提高DL的方法之一。,5. 速率理论的要点,组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。 速率理论表明：各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；

22、柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,五、 色谱分离度方程,对于被分析样品中的难分离物质对1与2，由于二者的物理化学性质很接近，故可合理认为：相邻两峰宽近似相等，即 Wb2 = Wb1=Wb，可导出下式：,式中， n: 柱效因子； ：选择性因子； k: 容量因子,影响分离度的因素,增大n提高柱效，但不改变柱长，则峰变窄，出峰时间不变。,增大k，改善分离，峰变宽；由于被固定相强保持，出峰时间延长。,增大，峰之间的距离拉大，出峰时间可能变化，是最有效的改善分离措施。,分离效果的判断,(a)选择性及柱效都不好 (b)选择性好，峰间距大，柱效不好，峰胖； (c) 柱效好，选择性如果能够提高一些，则更好。,例1：在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5，计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？ 解： = 100 / 85 = 1.18 n有效 = 16R2 / ( 1) 2 = 161.52 (1.18 / 0.18 ) 2 = 1547（块） L有效 = n有效H有效 = 15470.1 = 155 cm 即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,例2：在3.