HYT 153-2013 海水、沉积物中致突变性的测定 鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶试验

海水、沉积物中致突变性的测定鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验typhimurium/mammalsmicrosomal2013-04-25发布I Ⅲ 12规范性引用文件 13术语和定义 14方法原理 15仪器设备 16试剂和材料 27菌株选择、鉴定和保存 28样品采集和保存 39分析步骤 410结果判定 511结果计算 5附录A(规范性附录)菌株生物学特性鉴定标准及标准诊断性诱变剂 6参考文献 8表A.1菌株生物学特性鉴定标准结果 6表A.2标准诱变剂测定结果及表示方法 6表A.3推荐用标准诱变剂 7Ⅲ本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局东海环境监测中心提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本标准起草单位：国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局东海标准计量中心。1海水、沉积物中致突变性的测定鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验本标准规定了海水和沉积物中致突变性测定所需的样品采集、处理、试验、分析、计算等的技术要求。本标准适用于海水和沉积物的致突变性的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15193.4—2003鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验GB17378.5海洋监测规范第5部分：沉积物分析3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。回复突变reversemutation细菌在化学突变物作用下由营养缺陷型回变到野生型。鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验Salmonellatyphimuriumreversemutationtest利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基对置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型回复突变到野生型的试验方法。4方法原理人工诱变鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型),因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S-9)制备的S-9混合液。使用鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验检测海水或沉积物的致突变性。5仪器设备本试验应包括以下仪器设备：2a)低温高速离心机：温度4℃,转速12000r/min;b)超低温冰箱：-80℃,或液氮罐；c)洁净工作台；d)恒温震荡培养箱：37℃±1℃;f)蒸汽压力锅：121℃±1℃;g)K-D浓缩器；D采泥器；m)培养皿：直径90mm;n)其他实验室常用设备。6试剂和材料营养肉汤培养基、营养肉汤琼脂培养基、底层培养基、顶层培养基、0.8%氨苄青霉素溶液、0.1%结晶紫溶液、L-组氨酸溶液、0.5mmol/LD-生物素溶液、0.8%四环青霉素-四环素平板培养基、组氨酸-生物素平板培养基、二甲基亚砜(DMSO)(光谱纯)、S-9辅助因子(混合液试剂)、10%S-9混合液、活化系统(S-9或S-9混合液)的制备按GB15193.4—2003中第4章的要求执行。除非另作说明，所用试剂均为分析纯，培养基成分无诱变性，水为蒸馏水或等效纯水。所用试剂应避免高温处理。采用两株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA98、TA100。TA98可检测各种移码型诱变剂；TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂。7.2菌株鉴定7.2.1菌株鉴定要求菌株特性应与鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验标准相符(见附录A中表A.1)。突变型菌的某些特性易丢失或变异，遇到下列情况应鉴定菌株的基因型：a)在收到培养菌株后；b)当制备一套新的冷冻保存株或冰冻干燥菌株时；c)当每皿自发回复突变菌落数超出表A.1所规定的正常范围时；d)当对标准诱变剂丧失敏感性时；e)使用主平板传代时；f)投入使用前。37.2.2菌株鉴定方法7.2.2.1增菌培养将菌种接种于10mL已灭菌的营养肉汤中，37℃振荡培养14h～16h,每毫升活菌数不少于1×10⁹个，培养瓶避光培养。7.2.2.2组氨酸缺陷型的鉴定组氨酸缺陷型的鉴定按GB15193.4—2003中5.2.2的要求执行。7.2.2.3脂多糖屏障缺陷的鉴定脂多糖屏障缺陷的鉴定按GB15193.4—2003中5.2.3的要求执行。7.2.2.4R因子的鉴定R因子的鉴定按GB15193.4—2003中5.2.4的要求执行。7.2.2.5四环素抗性的鉴定四环素抗性的鉴定按GB15193.4—2003中5.2.5的要求执行。7.2.2.6uvrB修复缺陷型的鉴定uvrB修复缺陷型的鉴定按GB15193.4—2003中5.2.6的要求执行。7.2.2.7自发回复突变率的测定自发回复突变率测定按GB15193.4—2003中5.2.7的要求执行。7.2.2.8阳性对照7.2.2.8.1制备底层培养基平皿。7.2.2.8.2在2mL无菌顶层培养基中加入0.1mL增菌液和0.1mL阳性物(标准诱变剂测定结果见表A.2,推荐用标准诱变剂见表A.3),一式三份，摇匀，迅速将此管内容物倒入底层培养皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃培养48h。7.2.2.8.3结果判定：出现密集菌落(不小于2倍以上自发回复突变数)者为突变试验阳性。7.3菌株保存鉴定合格的菌株应直接超低温(-60℃~ℴ80℃)保存或在10mL增菌液中加入1.0mL二甲基亚砜后超低温(-60℃~一80℃)保存，保存期限一般不超过2年。8样品采集和保存8.1水样采集与保存采集前用待采集的水样荡洗密闭容器2次～3次，水样采集不少于25L,避免阳光直射，采集时应注意密闭容器中不留空隙，运输时避免剧烈晃动，常温保存时间不超过14d。8.2沉积物采集与保存沉积物采用采泥器采集，样品量不少于1000g,沉积物样品保存在惰性容器中，避光冷冻保存4(-20℃±1℃),保存时间不应超过2个月。9分析步骤9.1水样浓缩液制备9.1.1树脂处理9.1.1.1按质量比7:3称取XAD-2、XAD-7树脂，混合后用重蒸馏水洗去所含氯化物，去除浮于上层的树脂，用甲醇将水去除。9.1.1.2树脂应依次用丙酮、乙醚、甲醇各蒸馏回流8h,并最终保存在甲醇中。9.1.2层析柱安装按体积比1:10配制稀盐酸，并将玻璃棉用稀盐酸浸泡24h后用蒸馏水清洗2次～3次，再经丙酮、乙醚、甲醇各蒸馏回流8h。处理后的树脂倒入一支高70cm、直径3cm的层析柱内，树脂体积120mL～150mL。在层析柱底部及树脂柱上部放入经处理过的玻璃棉以支撑树脂并截留杂质，用1000mL蒸馏水冲洗层析柱。9.1.3水样吸附和过滤用虹吸法将25L水样以40mL/min流速通过层析柱。9.1.4盐分去除用1000mL蒸馏水冲洗，以40mL/min的流速通过层析柱。9.1.5有机物洗脱水样过柱吸附后用氮气吹干层析柱，将100mL色谱纯丙酮[视情况亦可用丙酮：甲醇(体积比)=3:7的混合溶剂]分3次，以3mL/min流速收集洗脱液于三角烧瓶。9.1.6有机物浓缩用过量无水硫酸钠过滤脱水后，倒入K-D浓缩器浓缩至2mL左右，于40℃水浴条件下用平稳氮气流将浓缩的提取液吹干，并用二甲基亚砜定容至2.5mL。9.1.7浓缩有机物保存定容后有机物样品置于4℃避光保存。9.2沉积物中浓缩有机物制备9.2.1样品预处理将样品风干、研磨后，经孔径为250μm～420μm的筛子过筛，采用四分法逐级缩分，直至选取大于400g的样品为止，常温避光保存。留取2份样品各100g,其中一份用于测定含水率。含水率的测定按GB17378.5的要求执行。9.2.2提取方法9.2.2.1索氏提取将100g沉积物样，放入索氏提取器，用300mL二氯甲烷在溶剂沸点条件下提取16h,使提取液冷5将100g沉积物样品放入研磨罐中，加入150mL二氯甲烷至少研磨30min,提取2次，9.2.4溶剂置换浓缩后有机物样品置于4℃避光保存。a)取底层培养基20mL,制备底层平皿42个；b)加入2mL融化的顶层培养基分装于无菌小试管中，在45℃水浴中保温；c)在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株新鲜增菌液0.1mL,混匀；按3个浓度梯度加入受不加测试物只加0.1mL二甲基亚砜，其他方法按9.3中的a)～d)执行；f)做完试验后一切带菌的器皿、培养基应及时经121℃高压灭菌20min。对待测物的每个剂量及阳性对照应列出每皿的实际回复突变菌落数及平均数，其中3个平行样回复突变菌落数相对标准偏差应小于30%。 (1)6(规范性附录)菌株生物学特性鉴定标准及标准诊断性诱变剂表A.1至表A.3分别给出了菌株生物学特性鉴定标准结果、标准诱变剂测定结果及表示方法以及推荐用标准诱变剂。表A.1菌株生物学特性鉴定标准结果自发回复突组氨酸缺陷脂多糖屏障缺陷(抗氨苄青霉素)十+十十十十十十注：组氨酸缺陷：“+”表示需要组氨酸；脂多糖屏障缺陷：“+”表示抑制带；R因子(抗氨苄青霉素有R因子；抗四环素：“一”表示无四环素抗性；uvrB修复缺陷：“+”表示表A.2标准诱变剂测定结果及表示方法叠氮钠32,4,7-三硝基芴酮 甲基磺酸甲酯2-乙酰氨基芴十十注：所列数值代表his+回复突变菌落数值，取自剂量反应的线性部分，对照值已扣除，用PCB0.005μg在TA100引起的回复突变菌落数小于70;丝裂霉素对uvrB菌株是致命的。7叠氮钠十2-乙酰氨基芴2-乙酰氨基芴8[1]GB/T15440—1995环境中有机污染物遗传毒性检测的样品前处理规范[2]邬建勇，王金辉，秦玉涛等.长江口表层水体的生态遗传毒性初步研究[J].海洋与湖沼，2006,37(1):20-27.[3]邬建勇，黄秀清，王金辉等.遗传毒性检测技术在海洋环境监测中的应用[J].海洋环境科学，2004,23(1):77-80.[4]UmbuzeiroGdeA,KummrowF,RoubicekgenotoxicityfromSantosEstuary(Brazil)inrelationtodischarges[J].Environment