荧光免疫标记技术

荧光免疫标记技术1荧光免疫标记技术5/9/2024免疫标记（immunolabellingtechnic）

是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。

通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。

可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定。具有高度敏感性、特异性、快速性。2荧光免疫标记技术5/9/2024

免疫标记技术主要分为：

免疫荧光技术：

放射免疫测定：自动化仪器价格昂贵、所用试剂半衰期

短、危及人体健康。敏感酶免疫技术：敏感、快速、简便、应用范围广、不需特

殊设备3荧光免疫标记技术5/9/2024免疫标记技术的应用

标记物与抗原、抗体的连接技术；标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理

以及相应的检测仪器的使用方法。4荧光免疫标记技术5/9/2024免疫荧光标记技术（immunofluorescencetechnique）将荧光素作为标记物与已知的特异性抗体以化学方法结合，形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物仍保留着抗体的活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它与相应的抗原特异结合后形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测

5荧光免疫标记技术5/9/2024免疫荧光标记技术始创于20世纪40年代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光黄（fluoresceinisothiocyanate，FITC）。Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。6荧光免疫标记技术5/9/2024

免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。

免疫荧光技术-基本原理7荧光免疫标记技术5/9/2024

荧光：是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素：是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。发生原理：基态激发态产生特点：激发---即刻产生停止激发---瞬间消失种类：光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光荧光8荧光免疫标记技术5/9/2024荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰减到一定程度所用时间。荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后发生的减弱现象。淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等荧光（标记）物质的保存荧光9荧光免疫标记技术5/9/2024用于标记的抗体：高特异性和高亲和力作为标记的荧光素应符合以下要求：应具有能迅速而稳定地与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。有强的荧光效应，即使标记后也不出现非特异染色荧光色泽,与背景组织的色泽对比鲜明。容易与自发荧光及其他荧光相区别（如双重标记时）与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。尽可能少褪色标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存有良好的水溶性，溶解后不与其它物质发生化学反应，纯净，可用标准试剂检验。10荧光免疫标记技术5/9/2024常用的荧光标记试剂:荧光素类

：标准荧光素及其衍生物异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）羟基荧光素（carboxyfluorescein,FAM）四氯荧光素（tetrachlorofluorescein,TET）罗丹明类（Rhodaminedye)标准荧光素的衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）11荧光免疫标记技术5/9/2024异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）外观：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子式：C21H11NO5S分子量为389.4纯度：≥95%(HPLC)最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。主要优点：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。12荧光免疫标记技术5/9/2024

异硫氰酸荧光素(FITC)13荧光免疫标记技术5/9/2024四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm呈橙红色荧光与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低14荧光免疫标记技术5/9/2024四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）橘红色粉末不溶于水，易溶于酒精和丙酮性质稳定，可长期保存最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm呈橘红色荧光15荧光免疫标记技术5/9/2024荧光FITC+RB200标记16荧光免疫标记技术5/9/2024荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定常用的荧光物质17荧光免疫标记技术5/9/2024荧光素FITC标记抗体当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下：

FITC-N=C=S+N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质18荧光免疫标记技术5/9/2024FITC标记方法：搅拌法：

适用于标记体积较大、蛋白质含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光试剂用量少，但此法所受影响因素较多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色出现。直接标记法间接标记法改良法透析法：适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较均匀，非特异性染色也比较少。19荧光免疫标记技术5/9/2024荧光抗体的纯化去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收20荧光免疫标记技术5/9/2024

【主要试剂与器材】1．器材（1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、

紫外分光光度计（2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸2．试剂（1）抗体（2）异硫氰基荧光黄（FITC）（3）葡聚糖凝胶（SephadexG-25）（4）pH9.5，0.5M碳酸缓冲液（5）pH7.0，0.005M磷酸缓冲液21荧光免疫标记技术5/9/2024取已知浓度的抗体蛋白溶液，用pH9.5，0.5M碳酸缓冲液稀释至最终浓度为20mg/ml。置于包黑纸的小烧杯中，并放入磁棒。称取适量FITC：按FITC(mg)/抗体蛋白(mg)的质量比为1/100，并计算出需要FITC的量。即：FITC的量(mg)=待标记抗体蛋白总量(mg)×0.01。将称好的FITC放在试管中，并用黑纸包好，然后取相当于稀释后抗体蛋白溶液体积1/10的pH9.5，0.5M碳酸缓冲液溶解FITC。开启搅拌器，将FITC溶液用滴管逐滴滴入含抗体蛋白溶液的烧杯内，加完后用pH试纸测试，如pH低于9.5，则用碳酸缓冲液调整pH至9.5，加盖搅拌1小时。用SephadexG-25装层析柱，用pH7.0，0.005M磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱。将上述标记液上SephadexG-25柱。用pH7.0，0.005MPB洗脱，流速控制为1ml/分钟。用三支试管收集：待黄绿色荧光走至离下端2cm处时，用第一支试管开始收集；当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用第二支试管收集全部黄绿色荧光溶液，待黄色荧光溶液在流出层析柱口时，换用第三支试管收集，直至流出液黄色消失，则停止收集。【操作方法】22荧光免疫标记技术5/9/2024记录收集管的OD495读数与OD280读数，

根据公式：

2.87×OD495F/P=——————————OD280－0.35×OD495

计算F/P值，并对该比值作一简单分析。【结果判断】23荧光免疫标记技术5/9/2024荧光抗体的鉴定（特异性和敏感性鉴定）效价抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质的结合比率荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。

24荧光免疫标记技术5/9/2024抗体工作浓度抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。可加入1:5000~10000的柳硫汞或1:1000~5000的叠氮钠，分装，真空干燥更易长期保存。25荧光免疫标记技术5/9/2024【影响标记的因素】温度:

温度低则所需标记时间长，温度高则标记时间短。在0-4℃时标记体需搅拌6-12h,而在7-9℃时搅拌4h即可,

20-25℃1-2h，37℃30-45minpH值:

pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜，在弱碱性条件下FITC易溶解，同时免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于两者结合。反应液中荧光试剂和免疫球蛋白的比例:抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。26荧光免疫标记技术5/9/2024【注意事项】严格掌握整个反应体系中的抗体蛋白含量，可提高标记效率。装柱及上样操作参照实验一。最后洗脱时应注意掌握洗脱速度及每管收集量。27荧光免疫标记技术5/9/2024光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG）光路：透射光、落射光荧光显微镜28荧光免疫标记技术5/9/202429荧光免疫标记技术5/9/2024自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)荧光抗体技术的应用30荧光免疫标记技术5/9/2024病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术的应用31荧光免疫标记技术5/9/2024免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用32荧光免疫标记技术5/9/2024细胞表面抗原和受体检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

特殊应用：流式细胞分析荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。

荧光抗体技术的应用33荧光免疫标记技术5/9/2024时间分辨荧光免疫测定：

蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等荧光偏振免疫测定：

药物、维生素、激素、常规生化项目等荧光酶免疫测定：

病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等荧光免疫测定的应用34荧光免疫标记技术5/9/2024间接免疫荧光检测自身抗核抗体35荧光免疫标记技术5/9/202436荧光免疫标记技术5/9/2024FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小荧光免疫显微技术37荧光免疫标记技术5/9/2024FALSSensor90LSSensorLaser侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少

荧光免疫显微技术38荧光免疫标记技术5/9/2024双色直接染色细胞荧光免疫显微技术39荧光免疫标记技术5/9/2024直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析横坐标为荧光或散射光强度纵坐标为细胞数荧光免疫显微技术40荧光免疫标记技术5/9/2024

荧光显微镜台式机---FACSCalibur双激光---488nm 635nm四荧光参数分选、浓缩系统41荧光免疫标记技术5/9/2024大型机---FACSVantageSE

多激光多波长八荧光参数高速分选单细胞点对点分选42荧光免疫标记技术5/9/2024

放射性同位素标记技术将被标记物分子中某个原子或几个原子被放射性同位素取代形成同位素标记化合物，是将同位素分析的高灵敏度于与抗原-抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法特异性强、灵敏度高、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化43荧光免疫标记技术5/9/2024可利用其衰变时放出的放射线进行测量，测量较灵敏而方便H3,C14,I131,I125H3,C14：不改变抗原的结构及其免疫学活性，标记的抗体可长期使用，标记繁琐，测定麻烦方法：氯胺T碘化法和Indogen包被法44荧光免疫标记技术5/9/2024酶标记技术通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存在，从而证明了