疟原虫检验技术

疟原虫镜检技术中国CDC寄生虫病所疟疾室郑香

5/9/20241疟原虫检验技术●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准”

仍然是血液显微镜检查●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准实验室技术5/9/20242疟原虫检验技术厚薄血膜的制作

镜检技术—血片制作制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄5/9/20243疟原虫检验技术取血部位和血量

取血方法采血部位：耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。5/9/20244疟原虫检验技术厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使血液沿边缘散开(如图示).5/9/20245疟原虫检验技术正确的推片姿势5/9/20246疟原虫检验技术标准的疟疾厚薄血膜片位置5/9/20247疟原虫检验技术各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片5/9/20248疟原虫检验技术厚薄血膜的标准

●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少

●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列5/9/20249疟原虫检验技术血片染色

两种染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法

常用吉氏染色法5/9/202410疟原虫检验技术吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(纯)250ml甲醇

(纯)250ml●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,

然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。●整个染色液配制时间不能少于5个小时5/9/202411疟原虫检验技术稀释吉氏原液●原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。

●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.5/9/202412疟原虫检验技术操作1（快染）

量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作2(慢染)在量筒内量2ml蒸馏水或净水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。吉氏染液浓度门诊染色5/9/202413疟原虫检验技术将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。成批血片染色5/9/202414疟原虫检验技术质量好的染色:

核呈红色,胞浆呈蓝色

如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片5/9/202415疟原虫检验技术染色过程将血片平置于染色板上.用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血膜上，染色10min。用流水轻轻冲去染液，注意不要冲走厚血膜。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后,用甲醇固定薄血膜5/9/202416疟原虫检验技术血片制作注意事项

●载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果．●干燥血片时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．●配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量．5/9/202417疟原虫检验技术原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法：●白细胞原虫密度计数法(厚血膜WHO)●半定量计数法(厚血膜)●红细胞感染率计算法(薄血膜)5/9/202418疟原虫检验技术●在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500~1000个）。●白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数÷计数的白细胞数×患者每微升血白细胞数=疟原虫数/μl血。●如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个白细胞计数(国际标准)。白细胞疟原虫密度计数法5/9/202419疟原虫检验技术白细胞疟原虫计数法举例●假设计数200WBC中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x8000（每微升血白细胞数）=1400/μl答：该患者的疟原虫密度为1400/μl。5/9/202420疟原虫检验技术用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋”4.平均每个视野6~10个虫，记录“++”5.平均每个视野11~100个虫，记录“+++”6.平均每个视野100个虫以上，记录“++++”。半定量计数法5/9/202421疟原虫检验技术薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。红细胞感染率计算法（薄血膜）5/9/202422疟原虫检验技术1.按以下公式计算：红细胞原虫感染率（%）=疟原虫数÷计数的红细胞数X1002.显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（300-500红细胞/视野）3.按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟原虫数4.如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％

红细胞感染率计算法（薄血膜）5/9/202423疟原虫检验技术如何确定疟原虫血片为阴性●检查全部厚血膜未查见疟原虫●

最少检查100个厚血膜油镜视野未查见疟原虫5/9/202424疟原虫检验技术人类四种疟原虫的

基本特征5/9/202425疟原虫检验技术感染人的疟原虫有四种:

恶性疟原虫P.falciparum

间日疟原虫P.vivax三日疟原虫P.malariae

卵形疟原虫P.ovale

5/9/202426疟原虫检验技术恶性疟P.falciparum

●

分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病●我国流行区域为云南省和海南省●四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治疗可危及生命5/9/202427疟原虫检验技术间日疟

P.vivax

●

间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区●

病程良性,有复发●

遍布全球温带地区及大片热带地区。在热带非洲，特别是西非则很少见5/9/202428疟原虫检验技术三日疟

P.malariae

遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告无复发卵形疟P.ovale又称蛋形疟原虫,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告在我国已基本消灭症状与间日疟相似,有复发5/9/202429疟原虫检验技术四种疟原虫的

诊断要点

5/9/202430疟原虫检验技术环状体钎细,红细胞不涨大一个红细胞内可有几个环状体,环状体内可有2个核

环状体可贴在红细胞边缘

血片中没有其他发育期滋养体配子体呈新月形或腊肠形成熟裂殖体约含8-26个裂殖子可出现茂氏点恶性疟（P.falciparum）鉴定要点5/9/202431疟原虫检验技术红细胞通常涨大薛氏点明显成熟环状体粗大滋养体胞浆有阿米巴样伪足可见各发育期滋养体成熟裂殖体约含12-24个裂殖子

间日疟（P.vivax）鉴定要点5/9/202432疟原虫检验技术红细胞不涨大或略小环状体可呈方形胞浆不活跃呈带状形成熟滋养体呈菊花状,内含6-12个裂殖子

核可能出现在环状体边缘

三日疟（P.malariae）诊断要点5/9/202433疟原虫检验技术卵形疟（P.ovale）诊断要点红细胞涨大

常见慧星状(也称齿轮状)环粗大薛氏点明显

成熟滋养体类似三日疟原虫,但更粗大成熟裂殖体约含6-14个裂殖子

5/9/202434疟原虫检验技术薄血膜中疟原虫寄生时

红细胞的变化间日疟原虫三日疟原虫恶性疟原虫卵形疟原虫涨大,色浅淡,略变形可见薛氏点(除早期环状体时)多重感染少见疟色素黄褐色,散在,呈小杆状正常,或略小正常染色时点彩不明显通常无多重感染色素见于早期,黑色颗粒状,见于细胞周围正常大小常见多重感染一些细胞呈黄色边缘较厚过度染色时茂氏点明显疟色素颗粒较粗新月形配子体外红细胞膜见不到大多数感染红细胞涨大通常呈卵圆形感染红细胞边缘破碎状薛氏点明显疟色素棕黄色,类似间日疟原虫5/9/202435疟原虫检验技术种周围血中发育阶段红细胞形态疟原虫形态大小点彩胞浆疟色素裂殖子数恶性疟原虫环状体配子体正常常见茂氏点环状体钎细，常见２个核粗黑，配子体中明显6-32

平均=10-24间日疟原虫各期滋养体裂殖体和配子体涨大,可达正常的1.5-2倍薛氏点可出现阿米巴样滋养体，浅蓝色，活泼金棕色不明显12-24

平均

=16卵形疟原虫各期滋养体裂殖体涨大,可达正常的

1.25-1.5倍薛氏点可出现卵圆形滋养体，蓝色较深，核较大深棕色明显6-14

平均=8三日疟原虫各期滋养体裂殖体和配子体正常西门氏点少见圆形，蓝色深，核紧缩，滋养体带状深棕色，粗明显6-12

平均

=8

呈菊花状5/9/202436疟原虫检验技术镜检示教以下血片采自现症病例5/9/202437疟原虫检验技术Thisisathinfilmfroma27yearoldfemalebackpacker,witharecenthistoryoftrekkingthroughNorthernThailandandhighfever.

AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.●Numerousfineringforms●Doublechromatindots●Marginalforms●Redcellsarenotenlarged5/9/202438疟原虫检验技术Athinfilmfroma22yearoldmaleholidayinginLombok(Indonesia)onemonthpreviously.Intermittentfeverssincereturning.AtypicalPlasmodiumvivaxpresentation●Salientfeaturesare:●Developingandthick(signet)ringforms●Enlargedredcells5/9/202439疟原虫检验技术RecenttravelinAfrica.Pyrexiaofunknownorigin.

AtypicalPlasmodiumovalepresentationDevelopingformofplasmodiumComet-like"redcellsEnlargedredcell5/9/202440疟原虫检验技术Femalepatient,arrivedfromBraziltwoweekspreviously.Flulikesymptomssincearrival.AtypicalPlasmodiummalariaepresentationBroadbandformofplasmodiumRedcellsnotenlarged5/9/202441疟原虫检验技术Thisisathickfilmpreparedfroma32yearoldmalerecentlyreturnedfromVietnam.NumerousringformofPlasmodiumcanbeseen(asindicatedbythearrows).Notesizeofneutrophils(forcomparison).TheonlydefinitivediagnosisthatcanbemadefromthisfilmisthatMalariaispresent.Thinfilmswouldhavetobeexaminedforspeciesidentification.5/9/202442疟原虫检验技术读片练习5/9/202443疟原虫检验技术2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.5/9/202444疟原虫检验技术3.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.5/9/202445疟原虫检验技术4.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C5/9/202446疟原虫检验技术5.MalerecentlyreturnedtoAustraliaafterbackpackingthroughAsia.Historyofflulike