生产菌种的培养与保存

生产菌种的培养与保存5/9/20241生产菌种的培养与保存第一节生产菌种的制备过程菌种→母斜面→子斜面→摇瓶菌丝→种子罐→发酵罐

5/9/20242生产菌种的培养与保存实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。5/9/20243生产菌种的培养与保存种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。5/9/20244生产菌种的培养与保存种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染5/9/20245生产菌种的培养与保存一、孢子的制备放线菌孢子的制备：营养要求：营养物质含量要低，特别是氮源培养基：琼脂斜面培养基培养温度：28~37℃培养时间：5~14天斜面含水量：低5/9/20246生产菌种的培养与保存

棒状链霉菌成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形，中间突起，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子为暗灰绿色，成熟后，孢子易于刮下棒状链霉菌出发菌株单菌落形态特征

5/9/20247生产菌种的培养与保存棒状链霉菌斜面一般培养四到五天左右产生孢子，六到七天斜面孢子生长成熟，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子呈暗灰绿色棒状链霉菌出发菌株的斜面培养特征

5/9/20248生产菌种的培养与保存霉菌孢子的制备：营养要求：碳、氮含量要低，无机盐适量培养基：天然农产品培养温度：25~28℃培养时间：4~14天

5/9/20249生产菌种的培养与保存细菌种子的制备：营养要求：营养丰富，氮源含量要高培养基：牛肉膏、蛋白胨培养温度：37℃培养时间：1~2天（芽孢5~8天）5/9/202410生产菌种的培养与保存二、摇瓶种子的制备一级摇瓶→二级摇瓶→种子罐三、种子罐种子的制备一级种子罐→二级种子罐→发酵罐（三级发酵）级数的确定：菌种的特性；发酵罐的体积5/9/202411生产菌种的培养与保存谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵

一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。5/9/202412生产菌种的培养与保存发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响

级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面5/9/202413生产菌种的培养与保存四、种子制备过程举例1、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵5/9/202414生产菌种的培养与保存斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次5/9/202415生产菌种的培养与保存一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基5/9/202416生产菌种的培养与保存二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基5/9/202417生产菌种的培养与保存种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列pH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛5/9/202418生产菌种的培养与保存2、青霉素生产的种子制备制备过程安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵5/9/202419生产菌种的培养与保存斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右5/9/202420生产菌种的培养与保存大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子5/9/202421生产菌种的培养与保存一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%5/9/202422生产菌种的培养与保存种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强5/9/202423生产菌种的培养与保存第二节生产菌种的质量控制一、影响孢子质量的因素1.培养基营养成分灭菌的质量斜面培养基的含水量5/9/202424生产菌种的培养与保存2.培养温度和湿度的影响菌体生长温度范围宽些28~37℃，孢子形成温度窄27、28℃3.培养时间过短：孢子不成熟；低温保藏时、易死亡过长：菌体代谢活力降低，产量低5/9/202425生产菌种的培养与保存4.保藏时间一般不超过一星期5.接种量在母斜面上形成单菌落，在子斜面上形成一层菌落5/9/202426生产菌种的培养与保存二、影响种子质量的因素及控制措施1.影响因素：①培养基②培养条件③培养时间最适种龄：对数生长期后期

5/9/202427生产菌种的培养与保存种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。菌龄过小：延迟期长，菌体生长缓慢，生物合成期缩短，产量降低种龄长：易老化5/9/202428生产菌种的培养与保存④接种量

接入种子液的体积接入后培养液体积接种量范围：1~25%，但是一般认为大一点好过大：菌体过度生长，营养物质及溶氧不能满足菌体需要，使菌体衰老、自溶过小：生产期延长，以产生菌丝结团，产量降低接种量=×100%双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。5/9/202429生产菌种的培养与保存2.种子质量的控制指标菌体的形态碳、氮、磷的代谢情况菌株的生产能力特殊酶活力5/9/202430生产菌种的培养与保存3.种子异常分析菌丝生长过慢：培养基质量不好；灭菌质量不好；通入空气的温度过低菌丝结团：接种量小；培养基粘度不当；搅拌不好菌丝粘壁：搅拌不好；装料系数少；泡沫多5/9/202431生产菌种的培养与保存第三节生产菌种的保藏一、微生物菌种的保藏要求要求：①是广泛收集各种研究、教学和生产性菌种，满足各方面需求；②高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰老、特性不变异、分类不紊乱；③随时可提供保持有原始特性的菌种用于交换和使用。5/9/202432生产菌种的培养与保存二、菌种保藏原理原理：将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等等，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。而一旦恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。5/9/202433生产菌种的培养与保存三、微生物菌种保藏的常用方法菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：

1、斜面低温保藏法2、

液体石蜡封藏法3、

沙土管保藏法4、甘油低温保存法5、真空冷冻干燥保藏法6、液氮超低温保藏法

5/9/202434生产菌种的培养与保存1、斜面低温保藏法4℃保存，1~3月2、

液体石蜡封藏法石蜡→灭菌→冷却→加入试管中

5/9/202435生产菌种的培养与保存3、

沙土管保藏法

1mol/L酸洗→1mol/L碱洗→蒸馏水洗→烘干→过筛→混合（3：2或1：1）→分装沙土管→

干接法：接孢子后，低温抽真空湿接法：接孢子悬液后，低温抽真空取沙取土（沙:20~40目）（土:40~60目）5/9/202436生产菌种的培养与保存4、

甘油低温保藏法

等体积混合→-20℃以下保存孢子悬液或菌体30~40%甘油

如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。5/9/202437生产菌种的培养与保存

通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。5、真空冷冻干燥保藏法5/9/202438生产菌种的培养与保存等体积混合→分装冻干管→冷冻至15℃以下→抽真空→封口→低温保存脱脂牛奶孢子悬液（洗净）5/9/202439生产菌种的培养与保存冻干菌种的保藏与再生1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。2．复苏：(1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿．(3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。5/9/202440生产菌种的培养与保存6、液氮超低温保藏法

10%甘油悬液→降温至0℃→缓慢降温至-35℃→放入液氮缸中→

液相：-196℃

（气相：-150℃）孢子悬液、5/9/202441生产菌种的培养与保存(一)冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

5/9/202442生产菌种的培养与保存(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤1．待冷冻保藏菌种悬液的制备(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。

5/9/202443生产菌种的培养与保存2．控速冷冻(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。5/9/202444生产菌种的培养与保存(三)复苏1．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解冻；3．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2ml无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。5/9/202445生产菌种的培养与保存常用菌种保藏方法的比较方法原理适宜菌种保藏时间特点冰箱低温（4℃）低温各大类微生物3-6个月简便石蜡油封藏低温、缺氧各大类微生物1-2年简便砂土保藏干燥、无营养产芽孢细菌、产孢子的放线菌、霉菌1-10年简便有效冷冻干燥保藏干燥、低温、无氧各大类微生