环节表面菌落总数大肠菌群的测定

环节表面菌落总数大肠菌群的测定5/9/20241环节表面菌落总数大肠菌群的测定一、开展微生物快速检测工作的意义据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，80％是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。2000年至2012年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％；化学性食物中毒占38.56％；动植物性和原因不明的食物中毒均占10％左右。传统的微生物检测方法，主要包括形态检查和生化方法，涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁多。5/9/20242环节表面菌落总数大肠菌群的测定1955年德国学者F.J.Forg发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法—纸片法，使原来的检测周期由72小时缩短到15小时，材料成本降低了四分之三，同时大大简化了操作程序。从此，这种生化检测方法开始发展起来。另外，将培养基固化在试剂盒中的速测盒法，也是一种较为简洁快速的检测方法，省去了大量的实验准备工作。5/9/20243环节表面菌落总数大肠菌群的测定二、开展微生物快速检测所需的基本条件一间通风良好、面积不需要很大的独立房间或野外帐篷；一个便携式紫外线消毒灯；一台便携式恒温培养箱；一个食品微生物快速检测箱，箱内备有实验用的工具和器皿、检测用测试片和试剂盒。有条件时，可增加一台高压锅或红外线消毒柜（家用消毒碗柜也可）；具备以上设备和无菌操作概念即可进行现场快速检测了。5/9/20244环节表面菌落总数大肠菌群的测定1.点燃酒精灯，营造局部无菌环境。取样和加样时尽量靠近酒精灯操作。操作工具如镊子、剪子、长柄勺、小刀等，在酒精灯上用火焰消毒后使用。2.用75%酒精棉球将手和样品开口处周围抹擦消毒。3.将无菌袋或无菌器皿放在天平上，用无菌器皿拿取样品称量25g或25ml，加入225mL生理盐水将样品溶解，或将样品放入盛有225mL生理盐水的均质管中将样品溶解（此为10倍样品稀释液），从中取1mL加入到无菌试管中，加入9mL生理盐水，混匀（此为100倍样品稀释液），一般情况下，取原液和10倍及100倍样品稀释液进行检测。4.餐饮具卫生状况的检测，按照国家标准GB14934纸片法进行。三、无菌操作和注意事项5/9/20245环节表面菌落总数大肠菌群的测定四、常见微生物检测项目常规微生物项目细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、霉菌及酵母菌致病微生物项目沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等5/9/20246环节表面菌落总数大肠菌群的测定传统计数改良法1、培养膜法2、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数3、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测快速检测的新方法1、ATP生物荧光法2、电阻抗法3、颜色变化4、流式细胞技术及激光扫描技术5、其它：热量法，放射测量法五、常规微生物检测方法5/9/20247环节表面菌落总数大肠菌群的测定培养膜法-快速检测纸片技术微生物测试片：是一种将脱水培养基附着于无无纺布棉垫上的即用型检测产品。原理二片塑料膜构成，上薄为盖，下厚为培养基。操作方法：检样稀释→取1ml滴于下膜正中央→盖上膜→37℃培养24h→计数(显色的斑点)计数：直接数出，若太多，可选择几个有代表性菌落的小方格分别计数，计算平均菌落数，再乘以20，即可得到整个测试片上估算的菌落数。

5/9/20248环节表面菌落总数大肠菌群的测定培养膜法-快速检测纸片技术优点：可节约玻璃仪器、培养基。可节省培养基等试剂的配置灭菌和玻璃仪器灭菌和清洗的时间、人力和费用。因为有显色剂和小方格，计数方便。节约稀释的繁琐动作。可快速测试致病菌，节省大量的实验步骤。缺点成本比传统方法要稍高些。测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养时间。5/9/20249环节表面菌落总数大肠菌群的测定培养膜法-快速检测纸片技术应用细菌总数测试片中含有一种红色指示染剂，使所有菌落易认别计数,48h可群定菌数。大肠菌群测试片中含有指示剂，使菌落为蓝色或蓝绿色,24h可确定大肠菌群数。大肠杆菌指示剂可使所有菌落为紫色。24小时可确定大肠杆菌数。5/9/202410环节表面菌落总数大肠菌群的测定霉菌和酵母菌计数测试片中加入的抗生素，可以抑制细菌生长；指示剂使酵母菌易认别计数；霉菌可产生特有的色泽。金黄色葡萄球菌使用了具有热稳定的核酸酶反应片，核酸酶反应产生的粉红色环带色围着一个红色或兰色菌落即为金黄色葡萄球菌，24小时可确认结果。培养膜法-快速检测纸片技术5/9/202411环节表面菌落总数大肠菌群的测定测试片检测结果图像5/9/202412环节表面菌落总数大肠菌群的测定5/9/202413环节表面菌落总数大肠菌群的测定螺旋平板法DWS螺旋平板接种仪自动菌落计数仪5/9/202414环节表面菌落总数大肠菌群的测定原理样品制备的菌悬液在琼脂表面形成阿基米德螺旋型轨迹。当用于分液的空心针从平板中心移向边缘时，菌液体积减少，注入的体积和琼脂半径间存在指数关系。培养时菌落沿注液线生长。用一计数的方格来校准与琼脂表面不同区域有关的样品量，计数每个区域的已知菌落数，再计算细菌浓度。螺旋平板法5/9/202415环节表面菌落总数大肠菌群的测定平皿旋转接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍阿基米德螺旋型轨迹螺旋平板法5/9/202416环节表面菌落总数大肠菌群的测定优点与传统方法相比，无需稀释梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。缺点检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。螺旋平板法5/9/202417环节表面菌落总数大肠菌群的测定滤膜法滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。优点灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。缺点需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。5/9/202418环节表面菌落总数大肠菌群的测定ATP生物荧光法原理ATP＋萤光素+萤光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化萤光素+光应用用于食品生产线和管道进行快速清洁程度检测。用于水质检测。改良后用于食品的商业无菌检测或终产品检验。5/9/202419环节表面菌落总数大肠菌群的测定10秒获得结果涂抹采样混合:震荡5s检测表面清洁度/水质检测ATP生物荧光法5/9/202420环节表面菌落总数大肠菌群的测定ATP法检测成品的优缺点优点：大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，有存在假阴性的可能。ATP生物荧光法5/9/202421环节表面菌落总数大肠菌群的测定电阻抗法测定细菌总数原理供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。阻抗变化的产生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值。5/9/202422环节表面菌落总数大肠菌群的测定

M=(R0-RT)/R0×100%其中R0表示开始时培养基的阻抗值RT表示任意时刻培养基的阻抗值M表示培养基电阻减少的百分数。电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位的对数Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。电阻抗法测定细菌总数5/9/202423环节表面菌落总数大肠菌群的测定优缺点：电阻抗法较省力，样品细菌数在4～18小时内出结果。但对于菌数太低的不好，样品中还不能用防腐剂，否则结果是乱七八糟的。电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管一只。电阻抗法测定细菌总数5/9/202424环节表面菌落总数大肠菌群的测定通过颜色变化检测微生物生长导致培养基pH值发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层的颜色变化，记录达到突变点的时间。与阻抗法类似，可以实现快速检测。缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。5/9/202425环节表面菌落总数大肠菌群的测定致病菌快速检测方法显色培养基法：技术成熟，产品很多。免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，荧光酶免、免疫磁分离等方法。分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。基因芯片5/9/202426环节表面菌落总数大肠菌群的测定（一）显色培养基法原理在选择性培养基的基础上经过改良。利用细菌特有的生理生化反应，使培养基中的指示剂产生颜色变化，以将目标菌与其他菌区别开来5/9/202427环节表面菌落总数大肠菌群的测定（二）酶联免疫技术—mini-Vidas全自动免疫分析仪利用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本。优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。5/9/202428环节表面菌落总数大肠菌群的测定（三）分子生物学方法基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。5/9/202429环节表面菌落总数大肠菌群的测定优缺点分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势。目前不少产品已经通过AOAC的认证。（三）分子生物学方法5/9/202430环节表面菌落总数大肠菌群的测定六、微生物检测流程图固体样品：取1:10溶解稀释液液体样品：取原液致病菌检测试剂盒36℃培养6h～18h如果某增菌液发生混浊即预示含有某种致病菌可将混浊的增菌液接种到相应测试片上，36℃培养18～24h验证结果1.食物中毒样品的快速筛查5/9/202431环节表面菌落总数大肠菌群的测定2.卫生指示菌与致病菌的监测固体样品：取1:10、1:100或1:1000溶解稀释液液体样品：取原液、1:10或1:100稀释液加入到各测试片或试剂盒中36℃培养根据各测试片或试剂盒的培养时间观察检测结果5/9/202432环节表面菌落总数大肠菌群的测定5/9/202433环节表面菌落总数大肠菌群的测定

加样培养阳性阴性液体样品：直接倒入试剂盒刻度处，培养18～24h观察结果固体样品：稀释后按以上操作。七、试剂盒大肠菌检测结果图像5/9/202434环节表面菌落总数大肠菌群的测定§2.1环节表面菌落总数的快速检测适用范围：餐厅、宾馆、饭店、食堂与个体摊点及其他直接入口的食品生产、加工和销售单位的环节表面的检测本次实验检测场所：冷菜间的砧板试剂：菌落总数测试片采样方法：接触法（涂抹实验）1）揭开覆盖薄膜，加1ml无菌生理盐水于无纺布棉垫上，使棉