肉原料肉中激素的测定技术（盐酸克伦特罗、莱克多巴胺）（肉制品检测）

激素（盐酸克伦特罗、莱克多巴胺）的测定概述瘦肉精知识概述1瘦肉精的测定方法2筛选-酶联免疫法法2.1定性和定量-液质联用法2.2定性和定量-气质联用法2.3目录页测定结果3瘦肉精知识概述11.瘦肉精是什么？指的是一类动物用药，包括盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林等，属于肾上腺类神经兴奋剂，“瘦肉精”添加到饲料中，可以增加动物的瘦肉量。2.瘦肉精的危害？食用含有“瘦肉精”的肉会对人体产生危害，常见有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，特别是对心脏病、高血压患者危害更大。长期食用则有可能导致染色体畸变，会诱发恶性肿瘤，至于究竟摄入多大量，如何导致恶性肿瘤，有关病例研究国内外尚无定论。但是，近几年，各地“瘦肉精”致人中毒的案例时有发生。瘦肉精知识概述1早在2002年，农业部、卫生部、国家食品药品监督管理局就发布公告，明令禁止在饲料和动物饮用水中添加盐酸克仑特罗和莱克多巴胺等7种“瘦肉精”。2008年，最高人民检察院、公安部规定新的刑事案件立案追诉标准，对使用“瘦肉精”养殖生猪，以及宰杀、销售此类猪肉的，将以生产、销售有毒、有害食品罪追究刑事责任。2.1筛选是否含有瘦肉精——酶联免疫法（ELISA)2.2瘦肉精的确证和定量——液相色谱串联质谱法2.3瘦肉精的确证和定量——气相色谱串联质谱法瘦肉精的测定方法22.1筛选是否含有瘦肉精——酶联免疫法（ELISA)瘦肉精的测定方法2(1)原理：基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。微孔板包被有针对克仑特罗IgG的包被抗体。克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，加入竞争性酶标记物、标准或试样溶液。克仑特罗与竞争性标记物竞争克仑特罗抗体，没有与抗体连接的克伦特罗标记酶在洗涤步骤中被除去。将底物（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中孵育，结合的标记酶将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量吸光度值，吸光度比值与克伦特罗浓度的自然对数成反比。2.1筛选是否含有瘦肉精——酶联免疫法（ELISA)瘦肉精的测定方法2备注：1.适用范围：新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中瘦肉精的测定。

也适用于生物材料（人或动物血液、尿液）中克伦特罗的测定2.本方法检出检出限：0.004ng～0.054ng(2)实验方法与步骤：遵照GB-T5009.192-2003

如果采用快速检测卡，则根据检测卡操作要求开展检测。2.1筛选是否含有瘦肉精——“瘦肉精”快速检测卡瘦肉精的测定方法2瘦肉精检测原理:“瘦肉精”快速检测卡应用了竞争免疫层析的原理，样本中的“瘦肉精”在流动的过程中与胶体金（或胶体硒）标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上“瘦肉精”－蛋白偶联物的结合。如果样本渗出液中“瘦肉精”含量大于3ng/ml，检测线不显颜色，结果为阳性。反之，检测线显红色，结果为阴性。2.2瘦肉精的确证和定量——液相色谱串联质谱法瘦肉精的测定方法2备注：1.适用范围：新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中瘦肉精的测定。

也适用于生物材料（人或动物血液、尿液）中克伦特罗的测定2.本方法检出检出限：0.5ng～4ng(1)原理：试样中的残留物经酶解，用高氯酸调节PH值，沉淀蛋白质后离心，上清液用异丙醇-丁酸丁酯提取，再用阳离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。(2)实验方法与步骤：遵照GB-T22286-2008

2.3瘦肉精的确证和定量——气相色谱串联质谱法瘦肉精的测定方法2备注：1.适用范围：新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中瘦肉精的测定。

也适用于生物材料（人或动物血液、尿液）中克伦特罗的测定2.本方法检出检出限：0.025ng～2.5ng(1)原理：固体试样减碎，用高氯酸溶液匀浆，液体试样加入高氯酸溶液，进行超声波加热提取，用异丙醇+乙酸乙酯（40+60）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水(98+2)溶液洗脱，洗脱液浓缩，经N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA)衍生后于气质联用仪上进行测定，以美托洛尔为内标，定量。(2)实验方法与步骤：遵照GB-T5009.192-2003.

瘦肉精的测定方法2备注在检测实验室，确证和定量瘦肉精时，相对于气质联用，更多使用液质联用。

结果计算与评价3酶联免疫法（ELISA)结果计算或者直接读取快速检测结果。（2）液相色谱串联质谱法结果计算(3)气相色谱串联质谱法结果计算备注：瘦肉精属于农业部明文规定禁止用于所有食品动物的兽药，国家标准是不得检出。酶联免疫法测定激素（盐酸克伦特罗、莱克多巴胺）-初筛检测依据1目录页

酶联免疫法检测瘦肉精2检测依据1检测标准：

GB-T5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定第三法酶联免疫法（ELISA筛选法）2.1酶联免疫法（ELISA)原理酶联免疫法检测瘦肉精2基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。微孔板包被有针对克仑特罗IgG的包被抗体。克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，加入竞争性酶标记物、标准或试样溶液。克仑特罗与竞争性标记物竞争克仑特罗抗体，没有与抗体连接的克伦特罗标记酶在洗涤步骤中被除去。将底物（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中孵育，结合的标记酶将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量吸光度值，吸光度比值与克伦特罗浓度的自然对数成反比。2.2操作2.2.1国标-酶联免疫法（ELISA))实验方法与步骤2(1)主要试剂：

高氯酸、异丙醇+乙酸乙酯(40+60)、克伦特罗酶联免疫试剂盒等(2)主要仪器:匀浆器、离心机微量移液器：单道20ul、50ul、100ul和多道50ul-250ul可调、酶标仪（配备450nm滤光片）酶联免疫法检测瘦肉精2.2.1酶联免疫法（ELISA))实验方法与步骤2酶联免疫法检测瘦肉精(3)测定提取肌肉、肝脏及肾脏试样准备竞争酶标记物、克伦特罗抗体、包被有抗抗体的微孔板条试样；准备试样：提取物取20ul进行分析。高残留的试样用蒸馏水进一步稀释。测定：详细过程参考实训指导书或国标GB-T5009.192-2003。2.2.1酶联免疫法（ELISA))实验方法与步骤2酶联免疫法检测瘦肉精(4)结果计算2备注：1.适用范围：新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中瘦肉精的测定。

也适用于生物材料（人或动物血液、尿液）中克伦特罗的测定2.本方法检出检出限：0.004ng～0.054ng酶联免疫法检测瘦肉精2.2操作2.2.2克伦特罗快速检测卡检测步骤2（1）取5

g匀浆去脂肪肉样（或肉泥）于50

mL离心管中，盖紧管盖。（2）将装有样品的离心管放入沸水中加热10

min，用微量移液器或滴管取出管中液体移至干净离心管中，冷却至室温（注意：样品温度应控制在20±5℃）。（3）取出检测卡，开封后平放于桌面，使用本产品附带滴管，吸取离心管中的上清液加3-4滴于样品孔中。（4）加样后3-5min，观察显色区，判断结果，其他时间判断无效。酶联免疫法检测瘦肉精液相色谱串联质谱法测定激素（盐酸克伦特罗、莱克多巴胺）-确证与定量检测依据1目录页液质联用法检测瘦肉精2检测依据1检测标准：GB-T22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法该标准为目前检验检疫、第三方检测液质联用测瘦肉精最常用的标准2.1原理液质联用法检测瘦肉精2试样中的残留物经酶解，用高氯酸调节pH值，沉淀蛋白后离心，上清液用异丙醇-乙酸乙酯提取，再用阳离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。2.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.1主要试剂甲醇（液相色谱纯）乙酸钠高氯酸氨水甲醇溶液

标准储备溶液；混合标准储备溶液；同位素内标物:克仑特罗-D9，沙丁胺醇-D3，纯度大于98%等2.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.2主要仪器:高效液相色谱-串联质谱联用仪:配有电喷雾离子源（ESI）、均质器、漩涡混合器离心机氮吹仪、真空过柱装置。2.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.3主要步骤（1）提取1.称取5g样品（均匀取样）于50ml离心管中，2.用移液枪加加20ml（2mol/L,PH=5.2）乙酸铵2.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.3主要步骤（1）提取3.均浆机均浆4.加标准品（1）内标100PPB各加200ml（2）外标10PPBug/kg250ml（3）β菌酶各30ml（假如仅做克伦特罗一项，无需加该酶）2.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.3主要步骤5.振荡均匀，放入37℃水浴锅震荡16h放置一夜（备注：样品中有油脂，需要加入正己烷；若无油脂，无需加入正己烷）6.离心9000r/min7min7.上清液过滤（用漏斗、定量滤纸）到另一新管,用乙酸铵冲洗滤纸详细过程参考实训指导书或国标GB-T22286-20082.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.3主要步骤2.净化（1）首先活化MCX固相萃取柱，具体操作方法为向MCX柱中依次加入3ml甲醇，3ml水，3ml0.1mol/l盐酸，注意需要等甲醇完全过柱后加水，水完全过柱后加盐酸。（2）上样：将离心所得上清液过柱。（3）淋洗：先加3ml0.1mol/L盐酸，再加3ml水，然后加3ml甲醇水（1:1），注意，淋洗的顺序和活化固相萃取柱时所加试剂的顺序完全相反，也是依次完全过柱。（4）洗脱：用6ml(乙酸乙酯＋甲醇＋氨水)混合液洗脱（10：9：10）。2.2实验方法与主要步骤2液质联用法检测瘦肉精2.2.3主要步骤（5）浓缩--用氮吹仪吹干样液，吹到似干非