肉制品中致病菌的检测（沙门氏菌）（肉制品检测）

食品中沙门氏菌检验标准（GB4789.4-2016)及解读检验必备物品二检验程序三目录页标准说明及适用范围一本标准代替GB4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法第5部分:沙门氏菌检验》。整合后的标准与GB4789.4—2010相比,主要变化如下:———修改了检测流程和血清学检测操作程序;———修改了附录A和附录B。一、标准说明及适用范围范围本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。二、检验必备物品1.检验所需仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、冰箱（2℃~5℃）、恒温培养箱（36℃±1℃,42℃）±1℃、均质器、振荡器、电子天平（感量0.1g）、无菌锥形瓶（容量500mL,250mL）、无菌吸管（1mL、具0.01mL刻度；10mL、具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头、无菌培养皿（直径60mm,90mm）、无菌试管（3mm×50mm、10mm×75mm）、pH计或pH比色管或精密pH试纸、全自动微生物生化鉴定系统。（检验必备物品）2.检验所需培养基、试剂：缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硫酸铋(BS)琼脂、HE琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、沙门氏菌属显色培养基、三糖铁(TSI)琼脂、蛋白胨水、靛基质试剂、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基、半固体琼脂、丙二酸钠培养基、沙门氏菌O、H和Vi诊断血清、生化鉴定试剂盒。三、检验程序（一）检验流程：预增菌增菌分离样品预处理血清学鉴定血清学分型(选做)生化试验结果与报告（二）检验步骤检测前的准备：尽可能缩短解冻时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤致病菌取样一定要均匀并具有代表性。培养基配制应按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末；加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量；往试管中放小导管时，注意处理气泡。（二）检验步骤1.预增菌无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器均质,若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH至6.8±0.2。于36℃±1℃培养8h~18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。注意:对所有样品均进行8-18h预增菌，强调无菌操作称取样品。（二）检验步骤2.增菌

移取培养过的样品混合物1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。（二）检验步骤3.分离用直径3mm的接种环取增菌液划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落。这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。BS琼脂：菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落。周围培养基不变。HE琼脂：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂：菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基：按照显色培养基的说明进行判定。（二）检验步骤4.生物化学筛选

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂，后直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h~24h，必要时可延长至48h，将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查，必要时可进行沙门氏菌生化群的鉴别。本步骤排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。三糖铁琼脂：沙门氏菌反应为：斜面产碱，底层产酸，产H2S。尿素琼脂试验：变红色为阳性，不变色或者变黄色为阴性。沙门氏菌为阴性。靛基质(吲哚)试验：沙门氏菌为阴性。ONPG试验：溶液变黄色为阳性，不变色为阴性。沙门氏菌ONPG试验为阴性。

赖氨酸脱羧酶试验：赖氨酸脱羧酶肉汤和氨基酸脱羧酶对照均变黄为阴性，赖氨酸脱羧酶肉汤变紫，氨基酸脱羧酶对照变黄为阳性。沙门氏菌为阳性。如果选择系统生化做生化试验,可根据初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,进行鉴定。（二）检验步骤5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。血清学试验必须基于生化试验的结果，不能单纯以血清学实验结果来报告最终结果。检查培养物有无自凝性、多价菌体抗原(O)鉴定、多价鞭毛抗原(H)鉴定6.血清学分型(选做项目)必要时进行沙门氏菌群的鉴别。血清学分型有利于诊断病情，有利于进行流行病学监测，进行流行病暴发溯源。1)O抗原的鉴定2)H抗原的鉴定3)Vi抗原的鉴定4)菌型的判定致病菌检测的方法

致病菌检验方法一目录页

沙门氏菌检验方法二致病菌检验方法1.大肠埃希氏菌检验方法2.志贺氏菌检验方法3.金黄色葡萄球菌检验方法4.副溶血性弧菌检验方法5.蜡样芽孢杆菌检验方法（大肠埃希氏菌检验方法）大肠埃希氏菌检验方法国标法参看食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验(GB/T4789.6)。检测大肠杆菌及其肠毒素的新技术、新方法很多。如用K88单抗血清对粪中K88菌检出率比常规培养法提高1倍，最小检测菌量为10000cfu/mL。987P酶标单抗对粪便和肠内容物最小检出菌量为2000cfu/mL。对致病性大肠杆菌毒力基因检测，过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出。如用免疫磁分离法检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157：H7，可提高了大肠杆菌O157：H7感染病例的检出率。（志贺氏菌检验方法志贺氏菌检验方法目前志贺氏菌检验多采用国标法(GB/T4789.5)。（金黄色葡萄球菌检验方法金黄色葡萄球菌检验方法MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法（副溶血性弧菌检验方法副溶血性弧菌检验方法副溶血性弧菌的检验多采用国标法(GB/T4789.7)（蜡样芽孢杆菌检验方法）蜡样芽孢杆菌检验方法蜡样芽孢杆菌检验多采用国标法(GB/T4789.28)。国标法免疫学标记检测方法

分子生物学方法其他检测沙门氏菌的方法沙门氏菌检验方法（国标法）国标法GB4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》对沙门氏菌的常规检验包括以下5个基本步骤：预增菌和增菌；分离；生化试验；血清学鉴定；血清学分型(选做项目)；结果与报告。免疫学标记检测方法.酶联免疫吸附法(ELISA).斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）.免疫荧光抗体技术.其它免疫学标记检测方法（免疫学标记检测方法）（免疫学标记检测方法）免疫学标记检测方法免疫标记技术就是将已知抗体或者抗原上标记上易显示的物质(标记分子)，通过检测标记物反映有无抗原抗体反应,从而间接检测出微量的抗原或者抗体。

所谓的标记分子是那些即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出来，高敏感性的标记分子主要有突光素、酶、放射性同位素3种。免疫标记技术不仅大大提高了试验的敏感性，和光镜或电镜技术结合后，能对待检物质做精细定位，为临床研究和诊断提供了极大的方便。（酶联免疫吸附法）

酶联免疫吸附法(ELISA)ELISA的原理是是把抗原或抗体预先结合在某种固相载体表面，然后加入受检样品和酶标抗原或抗体使其与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质含量。该法灵敏度高、特异性强，可避免人为因素造成的假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品，（斑点酶联免疫吸附法）斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）Dot-ELISA是以纤维素膜作为固相载体的一种新型免疫检测技术，其原理与常规ELISA法相同，可用于抗原或抗体的定性或定量检测。其与ELISA的不同之处在于：一是将固相载体以硝酸纤维素滤膜、确酸醋酸混合纤维素滤膜、重氮节氧甲基化纸等固相化基质膜代替，用以吸附抗原或抗体；二是显色底物的供氢体为不溶性的，结果在基质膜上出现有色斑点进行判定。该方法具有简单、快速、灵敏、特异性强等特点,并具有较高的可重复性，而且阳性反应色斑易于观察,阳性检出率也高于常规分离培养法，且整个操作过程不需要任何特殊仪器，适用于大批量样品的快速检测，可以节省大量人力、物力、财力，便于在基层单位推广应用（免疫荧光抗体技术）免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。（其它免疫学标记检测方法）其它免疫学标记检测方法免疫磁性分离法是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，通过与样品中靶细菌的特异性结合和外加磁场的作用，使靶细菌得到分离、浓缩。此技术直接检测细菌特异性好，但灵敏度低。分子生物学方法.核酸探针.聚合酶链式反应技术(PCR).环介导等温扩增技术（LAMP）.基因芯片技术（分子生物学方法）（核酸探针）核酸探针通过酶切质粒DNA来进行，它主要采用一定数量的限制性内切酶，对提纯质粒的DNA酶切，分别得到不同DNA片断，用于检测食品中沙门氏菌的存在（聚合酶链式反应技术(PCR)）聚合酶链式反应技术(PCR)PCR技术是一项体外酶促扩增DNA技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。目前，PCR技术是一种快速、简便、特异、灵敏检测沙门氏菌的方法。（环介导等温扩增技术）环介导等温扩增技术（LAMP）LAMP技术的原理是针对靶基因的6

个区域按照规定的顺序设计4种特异的引物，因此

LAMP

技术扩增的特异性很高，只要出现扩增就可以判定靶基因存在。同时，在DNA

延伸合成过程中，从

dNTP

中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生白色的焦磷酸镁沉淀。

因此只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否[25]。LAMP

技术具备操作简单、特异性强、反应快速、灵敏度高的特点，LAMP

技术在微生物检测方面上得到了广泛的应用。（基因芯片技术）基因芯片技术基因芯片是一种固定有很多已知序列

DNA

探针的硅片或玻片。将经过荧光标记的样品分子与基因芯片上的

DNA探针进行杂交，通过检测每个探针分子的荧光信号强度以得到样品分子的数量和序列信息，基因芯片表面的

DNA

探针从几十到几百万个不等，可以一次性检测多种病原菌，并同时得到病原菌的耐药性等情况。（噬菌体