芽孢杆菌分离筛选与培养

1芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.7~0.8μm×2.0~3.0μm,营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性,芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱，菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥不透明，灰白色或微带黄色，扩散(蔓延)生长。斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中,易在枯草浸汁中繁殖。琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色,菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱,生长温度最高为45~55℃,最适为37℃。枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶冻化牛乳还原硝酸盐不产生吲化氢V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧。地衣芽孢杆菌孢囊不膨大，无伴孢晶体，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。革兰氏液染色呈紫色阳性菌。细胞大小一般在0.9~1.2×2.2~3.8微米。菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。1.样品：外购菌种商品微生物制剂(固体或液体)土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草(记录取样位置PH植被情况等)。2.菌种分离与纯化2.1.培养基2.1.1可溶性淀粉3g/L蛋白胨10g/L酵母膏3g/LKH2PO41.5g/L2MgSO40.1g/LPH7.4—7.6(富集用)2.1.2肉汤(NA)培养基(营养琼脂):蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaC15g/LPH7.2—7.4(保存计数或分离纯化用)营养琼脂：麦芽汁培养基=1:1混合使用,菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖3.5g/LNaC15g/LK2HPO40.5g/LMgS043g/LMnS0425mg/LPH7.2—7.4(分离纯化2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉3-5g/L蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/LPH7.2—7.4(用于淀粉酶产生菌分离筛选)2.1.5产蛋白酶菌株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：★★2.1.5.1.1葡萄糖1g/L,酵母膏1g/L,酪素4-5g/L,K2HPO41g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO40.1g/L蒸馏水1000ml,pH7.0-7.2。另：葡萄糖0.5g/L,酪素10g/L,NaC15g/LK2HPO40.5g/L,KH2PO40.5g/L,琼脂20g/LpH7.2-7.42.1.5.1.2牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解(10-15min),补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。2.1.5.1.3酵母膏0.05g/L酪素4g/LKH2PO40.36g/LNa2HPO₄1.1g/LMgSO40.5g/LNaC10.16g/LFeS040.002g/LCaC120.002g/LZnC120.014g/LpH6.5-7.04%酪素母液制备：4g酪素溶解于0.1N的30-35mL的氢氧化钠溶液中，水浴溶解20min,溶解完毕后加入60-70℃热水定溶到100mL.200mL培养基加20mL,★★2.1.5.2脱脂奶培养基：牛肉膏3g/L(酵母浸粉5g/L)蛋白胨10g/LNaC15g/L脱脂奶粉10-12g/L,PH7.2(用于蛋白酶产生菌的筛选)将脱脂奶(粉)加水溶解制成10%溶液，于115℃加热灭菌20-30min,与牛膏蛋白胨固体培养基1:9混合均匀倒平板。2.1.6纤维素产生菌培养基:CMC-Na2g/L蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaC15g/LPH7.2-7.4(用于纤维素产生菌的筛2.1.7促芽胞形成培养基：土壤浸出液1000mL蛋白胨5g/L牛肉膏6g/LPH7.2—7.4蛋白胨1g/L酵母膏0.7g/L葡萄糖1g/L(NH)₂soo.2g/LMgSO40.2g/L3,产芽孢培养基：蛋白胨10g/L产芽孢培养酵母膏0.1g/L2.1.8产蛋白酶发酵培养基:玉米粉30g/L豆饼粉20g/L钾0.3g/LPH7.2—7.4(分离纯化用)牛肉膏3-5g/LNaC15g/L.玉米粉0.5g/L麸皮10g/L磷酸二氢钠4g磷酸二氢碳酸钠1.0g/LPH7.4—7.6八层纱布塞，牛皮纸扎好。2.1.9产淀粉酶发酵培养基:玉米粉40g/L豆饼粉20g/L蛋白胨5g/L硫酸铵4g/L磷酸二氢钠酸二氢钾3g/LPH7.4—7.6八层纱布塞，牛皮纸扎好。产酶培养基(蛋白淀粉酶):蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1g/L可溶性淀粉5g/L磷酸二氢钾2g/LMgS040.5g/LCaC120.2g/LPH7.0-7.42.2分离纯化(或复壮)2.2.1冻干管的活化及菌种复壮:活化：用无菌吸管吸取0.5mL无菌水滴入安管中，轻荡使干菌体溶解成菌悬液，做梯度稀释后取0.1-0.2mL涂布或直接划线于肉汤(麦芽汁)培养基平皿，或转接于斜面(活化)37℃24-36h。复壮：挑取选择生长快，菌落大的菌落于4.5mL无菌水试管中，振荡摇匀后置于80℃水浴加热15-20min,梯度稀释后涂布于促芽胞形成培养基平皿或蘸取菌悬液直接划线，37℃24h。反复二至三次，选取平皿上菌落大而且生长快的菌落转接于斜面37℃18-20h,4℃冰箱保存。2.2.2商品微生物制剂中菌种选育1g(1mL)商品制剂加入99mL无菌(生理盐)水/250mL三角瓶(带玻璃珠),置于摇床振荡20-30min,80-85℃水浴加热15-20min,进行梯度稀释成10⁵、10⁶、10⁷,根据活菌含量选取两至三个梯度进行混菌或涂布35℃-37℃24h,挑取一环生长快，菌落大的不同典型菌落分别转接5mL无菌水试管中，混合器混合5-10min,做成菌悬液菌悬液直接划线，37℃18-20h。结合镜检直梯度稀释后混菌或涂布,或直接蘸取到菌落大小基本一致，转接于斜面37℃于4℃冰箱保存。或将梯度菌素培养基液1mL加入平板，然后分别注入淀粉和酪4中，30-37℃24-48h,挑取D/d大的(淀粉培养基加碘液，观察透明圈)转斜面备用或用划线法进行纯化。并通过染色镜检观察，从菌落形态和细胞形态进2.2.3自然筛选2.2.3.1富集培养取5g底泥或肠道内溶物0.5g,加入45(50)mL无菌水/250mL三角瓶(带玻珠)中，振荡15-20min,取5mL菌悬液或5mL水样加入45mL促芽培养基/250mL三角瓶中，75℃-80℃水浴15-20min,降至35℃-37℃150-200r/min振荡24h,染色镜检，连续两至三次培养备用。或取1g底泥(土)置于20mL肉汤培养基/250mL三角瓶，八层纱布封口，75℃-80℃水浴处理15-20min,然后150-200r/min振荡24h。镜检形成芽孢情况，挑取具有芽孢的菌落进行划线纯化培养，获得单菌落。2.2.3.2分离纯化取富集菌液置于75℃-80℃水浴15-20min,梯度稀释10³、10⁴、10⁵、10⁶、107,选择三个合适的梯度混菌或涂布于营养琼脂麦芽汁培养基或直接涂布于酪素培养基上初筛，也可划线分离(划线法先将平板置于30℃(24-48h)或37℃(18-24h),无菌检查，表面冷凝水干燥)。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于35℃-37℃24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面备。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。2.2.3.3菌种筛选蛋白酶产生菌株筛选：操作程序：样品溶解稀释—热处理(75-80℃)--梯度稀释—平板涂布培养一单菌落编号(转接斜面)--镜检(涂片芽孢染色)--初筛(点接酪素平板)—复筛(接产酶培养基培养，离心取清液蛋白酶活力测定)--转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥粗糙不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于酪素平板，35℃-37℃24-48h,菌落周围出现透明圈，挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。产蛋白酶发酵培养基35℃-37℃振荡培养24-48h,发酵过滤或离心，取清液检测蛋白酶活力进自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶的活力有很大差异，有的活力大于4000U/ml。C/H大菌落，其蛋白酶不一定大，因此，对初筛C/H大菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活测定进行复筛。淀粉酶产生菌株筛选：样品溶解稀释—热处理(75-80℃)--梯度稀释—平板涂布培养一单菌落编号(转接斜面)--镜检(涂片芽孢染色)--初筛(点接淀粉平板-滴加碘液)—复筛(接产酶培养基培养，离心取清液淀粉酶活力测定)--转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥粗糙不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于淀粉平板，35℃-37℃24-48h,取0.02mol/1碘液或卢戈氏碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，观察形成透明圈的结果，5挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。接入产淀粉酶发酵培养基35℃-37℃振荡培养48h,发酵过滤或离心，取清液检测淀粉酶和糖化酶活力进行复筛。菌种鉴定：染色显微镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。菌落扁平，圆形或近圆形，表面粗糙，乳白色。镜检菌体杆状，单个或链状,革兰氏染色阳性，芽孢圆形或柱型，中生或近中生。菌株的糖醇利用，产酸产气，生长温度，酸碱度PH,耐盐试验(7%),溶菌酶抗性，V-P试验，M-R试验，接触酶反应，吲哚反应，明胶液化，淀粉水解，硝酸盐还原，对氧需求(厌氧生长),柠檬酸盐利用，酪素水解，尿素利用等。常见的稀释方法：培养皿稀释法：5-6个无菌培养皿，分别滴一滴无菌水或生理盐水，接种环蘸取菌悬液与第一培养皿无菌水混合，在与第二培养皿无菌水混合，依次第三四五六，在各培养皿注入45-50℃培养基12-15mL混匀，倒置培养，在四五六得到单菌落。平板稀释法：取平板4-5个(干燥无冷凝水),在第一平板滴一小滴稀释菌悬液，无菌涂棒涂布，然后用此涂棒在另一平倒置培养，在四五六得到单菌落。试管稀释法(常用法)早芽孢杆菌一般生理生化试验项目：试验项目12标准菌(枯草芽孢杆菌)革兰氏染色十十糖发酵试验氧需求(厌氧生长)++十葡萄糖十)果糖十十+酪蛋白水解果糖十十+淀粉水解十十十蔗糖+板涂布至4-5。++(产酸不产气十+(产酸不产气)明胶水解硝酸盐还原柠檬酸盐或动力试验石蕊牛奶还V-P试验M-R试验PH5.7接触酶尿素利用3.种子培养3.1.培养基十十十麦芽糖十十十丙酸盐试验十十+木糖十十十十十十甘露醇或山梨醇+十十ITR十十渗透压试验7%氯化钠+十十十十十10%氯化钠+十十3.1.1蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaCl0.5g/L葡萄糖2g/LK2HPO43.1.2蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖30g/LK2HPO44.5g/L(NH)₂SO₄2.5g/LCaCO32g/LPH7.07.23.1.3蛋白胨5g/L酵母膏1g/L牛肉膏3g/L葡萄糖5g/LMgSO460.5g/L3.1.4淀粉10-30g/L酵母膏5-10g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/L3.2.种子培养3.2.1液体培养3×50mL/250mL三角瓶35℃-37℃18-20h芽孢率90%以上7×350mL/1000mL三角瓶接种量5%(火焰下接入) 接种量5%200r/min种子罐0.6T/T 1-2h静止培养3h后连续搅拌至终止3.2.2固体培养①培养基a.麸皮75%花生麸15%玉米粉5%豆粕5%b.麸皮80%稻壳10%玉米粉5%豆粕5%MgS040.05%MnS040.01%c.麸皮80-90%细糠5-15%葡萄糖2-5%②固体培养膨润土1-5%K2HPO41-3%d生物PH7.0-7.2(专利)30g/500mL三角瓶37℃(30℃)斜面活化30-50mL/500mL三角瓶1-2环菌苔或菌悬液料水比1:1.2-1.3接种量2%-3%(V/M)M为水料和,静止培养。拍打三次发酵周期40-48h →帘子曲堆积1-2h上帘重视划帘料层厚度2-3cm接种量0.3-0.5%控制品温37℃(30℃)38-40h4.发酵床(罐)培养4.1.1固体培养基(同种子)4.1.2液体发酵培养基A.玉米淀粉3g/L豆饼粉6g/L蛋白胨3.5g/L尿素3g/L葡萄糖5g/LB.玉米淀粉8g/L豆饼粉25g/L葡萄糖10g/LMgSO45g/LMnSO4NaH2P0₄0.5g/LNa2HP0₄2.3g/LPH7.2-7.4C.玉米粉10g/L玉米浆1.5g/L豆饼粉20g/L尿素1g/LK2HPO43g/LKH2PO41.5g/LMgSO41g/LMnS040.2g/LPH7.2-7.4消泡剂(植7物油)D.糖蜜20%味精废液2-3%玉米浆1.0%KH2PO42g/LPH7.2-7.44.2.固体发酵床培养4.2.1发酵床结构：长度：5.5-8.0m宽度：1.5-2.5m高度：0.5-0.6m4.2.2生产操作10生产条件：料水比：1:1.2-1.3PH7.O-7.2接种量：帘子曲0.3-0.5%液体种子3-5%(V/M)发酵温度：35℃±1℃(不超过37℃)a.料菌均匀后堆积1-2h上床摊平，厚度30-35cmb.温度控制：6-8h间断通风控制品温37℃以下10-12h以后连续通风20h左右第一次翻曲，温度37℃以下28h视品温.结块情况二次翻曲，温度保持在35℃-37℃c.定时镜检：芽孢达到80%以上停止发酵革兰染色显微镜观察。山东宝来利来：当料温降至40-50℃接种，接种量10%(液体),均匀后进行发酵，整个发酵分二个阶段：第一阶段(1-22h):1-10h静止期，10h后间断通风控制温度在37℃,20h左右第一次翻曲。第二阶段(23-40h):28-30h第二次翻曲，控制温度在37℃,直至发酵结束。发酵期间定时镜检，当芽孢率达到80%以上停止发酵，60℃低温烘干。4.3.发酵罐培养4.3.1发酵条件:接种量：5-10%PH:7.0-7.2装料量：60-70%温度：30℃-35℃种龄：18-20h(发酵周期22-24h)定时搅拌：1-8h间隔2h搅拌一次每次10-15min9-16h连续搅拌(通无菌空气)17-22h间隔2h搅拌一次每次10min4.3.2发酵过程检测：达到如下指标放罐：芽孢含量：≥70%杂菌污染：≤3%含菌量：>30亿cfu/mL4.3.3发酵菌液处理：a.菌液分离：离心、喷射、板框过滤，以离心分离为好。植物性：麸皮、淀粉、黄粉。矿物性：沸石粉、麦饭石、草炭、轻质碳酸钙。光合细菌：载体=1:4,酵母菌：载体=1:3-4,芽孢杆菌：载体=1:5-6.85.芽孢杆菌保存：枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌芽孢杆菌等。培养基：肉膏蛋白胨(保存培养基短小芽孢杆菌短短要求有机氮多，稍含或不含糖)短期保存：5.1.斜面保存法：枯草杆菌斜面透明粘稠,似流体。地衣芽孢斜面结合较紧密，不易挑起。4-6℃3-6月转接一次。液体石蜡保存法：斜面和高层半固体柱4-6℃1-2年转接一次。不适合肠细菌属葡萄球菌乳杆菌属。适合实验室长期保存。5.2.甘油保存法：-20℃或-70℃冰箱保存，2-3年转接一次。5.3.冻干保存法：4-6℃保存10-15年。5.4.沙土管保存法：4-6℃保存10-15年。★★1.吸附剂对微生物生存活性影响1.1载体：草炭有机质含量49%,PH:6.5颗粒60目麸皮小麦麸皮，颗粒60目.轻质碳酸钙水分6%颗粒100目沸石粉含有多种营养物质水分10%颗粒80目1.2菌种：蜡祥芽孢杆菌酵母菌各1500mL培养24h,菌数10亿1.3试验结果a.吸附剂对蜡祥芽孢杆菌的影响吸附存放7天和15天时，各处理间有效菌数变化不明显，30天草炭和轻质碳酸钙相差1亿。90天草炭、麸皮、轻质碳酸钙和沸石粉存活率76%67%44%57%,说明草炭对蜡祥芽孢杆菌的影响较小，轻质碳酸钙90天就有50%微生物死亡。b.吸附剂对酵母菌的影响吸附存放7天轻质碳酸钙菌数死亡率66%,30天草炭、麸皮、轻质碳酸钙和沸石粉存活率20%62%5%29%说明麸皮对酵母菌的影响较小。c.不同固液比对蜡祥芽孢1:2菌数上升,30天降到杆菌酵母菌有效活菌数的影响蜡祥芽孢杆菌处理七天，出现不同的菌数初始基础菌以下，60天存活率46%.1:41:天存活率68%66%65%。酵母菌处理七天1:2菌数上升，60天降到初始基础菌以下，1:41:61:860天存活率62%67%58%,从水分角度考虑固液比应控制在1:4以上。9★★2.包包曲中五株枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定营养琼脂：蛋白胨10g/L牛肉膏3g/L氯化钠5g/LPH7.0-7.2产蛋白酶筛选培养基：脱脂奶粉12g/L营养琼脂20g/LPH7.2产淀粉酶筛选培养基：可溶性淀粉5g/L氯化钠5g/LPH7.2产纤维素酶筛选培养基：羧甲基纤维素钠2g/L蛋白胨10g/L酵母膏5g/L氯化钠10g/L,PH7.2无菌条件下,取包包曲1.0g加入盛有99ml无菌水三角瓶中，先静置10-15min,然后置摇床振荡20-30min,取10ml菌悬液于无菌试管中，80℃保持15-20min,杀死非芽孢菌体，取1.0ml处理液梯度稀释至10-6,涂布或混菌,37℃培养24h,挑单菌落革兰氏染色，芽孢染色，镜检观察。选取有芽孢的阳性菌，传代2-3次达到稳定，转接于斜面保存。菌株分离纯菌株12345化结果：菌落形态乳白，边缘不规则表面粗糙，无隆起其他同上隆起亮红色其他同1浅褐色，边缘整齐表面光滑浅褐色，边缘不规则表面光滑较干燥，仍粘壁革兰氏染色十十十十十芽孢情况近中生中生中生端生近中生3.菌种的筛选:3.1菌株产蛋白酶活力比较和筛选：挑选单菌落点接于牛奶或酪素培养基，37℃培养2-3d,用产生透明圈表示酶活力。透明圈大小(mm):15.210.59.814.213.5透明圈大小排序：145233.2菌株产淀粉酶活力比较和筛选点种37℃培养2-3d,滴加碘液显透明圈大小排序：123453.3菌株产纤维素酶活力比较和筛选点种37℃培养2-5d,滴加刚果红显色，再用1mol/1氢氧化钠脱色。透明圈大小1(mm):7.9透明圈大小排序：51243由上所知：145三株具有分解酪素淀粉纤维素能力，3只能分解酪素和淀粉,部分菌株具有较高单一消化酶活力。4目标菌株的鉴定：4.1形态鉴定：将菌株1接种在营养琼脂培养基上,37℃培养24h观察。菌落形态：菌落近似圆形，表面光滑，不干燥，粘壁，菌落中间颜色较边缘深,边缘不规则,乳白色表面色暗，不透明。菌体形态：革兰氏阳性,短杆状，以成对或链状排列，运动，芽孢近中生,接近枯草芽孢杆菌。4.2生理生化特征：目的菌株与枯草芽孢杆菌生理生化比较：枯草芽孢杆菌十2枯草芽孢杆菌十2微生长- 十++厌氧生长： 十++5.9-8.06.5-8.03.8-7.35.0-7.55.0-8.05.9-8.06.5-8.03.8-7.35.0-7.55.0-8.0:+:+b十十 十十十十b十b最高生长温度：最低生长温度：PH5.7营养肉汤PH6.8营养肉汤10%葡萄糖：十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十+阿拉伯糖木糖+十+十十+十+十十十十十+十十十淀粉明胶酪素酪氨酸还原硝酸盐利用柠檬酸形成吲哚利用丙酸盐十十十十十十十十十十十十从生理生化性能与枯草芽孢杆菌相似，初步判定五株菌株都为枯草芽孢杆菌。★★3.商品纳豆产品中高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛1.材料与方法:1.1分离材料：超市购买的北京大连日本三产地的纳豆产品。1.2模式菌株：N1型纳豆芽孢杆菌，中国农科院提供。1.3培养基；营养琼脂：酵母粉5g/L大豆蛋白胨10g/LNaCl5g/LPH7.0-7.2.酪素蛋白平板：酵母粉5g/L酪蛋白10g/LNaCl5g/LPH7.0-7.2.种子培养基：蔗糖10g/L大豆蛋白胨10g/L氯化钠5g/LPH:7.0-7.2发酵培养基：葡萄糖10g/L蔗糖10g/L大豆蛋白胨20g/LK2HPO44.0g/LKH2PO42g/LMnS040.5g/LCaC120.2g/LPH7.0-7.2.1.4样品液的制备：无菌条件下，分别称取三种产品各1.0g加入99mL/150m三角瓶无菌水中，置于摇床振荡20-30min,吸取上清菌液4℃保存使用。1.5菌株分离和初筛：三种样品液在80℃水浴15-20min以杀灭营养菌体和杂菌，待温度降至40℃以下进行梯度稀释，取适当的稀释度(10⁷、10⁸、10-°·)0.1mL涂布于酪素蛋白平板上，37℃倒置培养24h,计数(用营养琼脂)或各选择10株透明圈直径和菌落直径菌落大小排列，从中各选取三株，按照进行连续划线培养至纯(结合镜检)。将纯化菌株转接于营养琼脂斜面保存备用。结果：芽孢杆菌计数分别北京10⁷大连109日本1081.6菌株鉴定:1.6.1菌落形态鉴定：营养琼脂培(粘性)颜色(白色)边缘(不整齐)N1型纳豆芽孢杆菌比较。养24h菌落形态(圆形)大小干湿表面(干燥起皱)(不)透明，初筛的9株燥边缘不整齐中间颜色深菌落形态相同，与N1型纳豆芽孢杆菌成裂叶状表面皱褶不透明有粘性白色于边缘部分，斜面菌落呈树状。一致，均为圆形干或灰白色菌落，1.6.2菌体形态鉴定：培养16h菌体进行染色，革兰染色情况形态大小排列方式与N1型纳豆芽孢杆菌比较。菌体形态与N1型相似，染色为兰紫色，短杆状，两端钝圆，大小2.0-4.5微米。芽孢椭圆形,中生或次中生。归属于芽孢杆菌属。由于培养16h时菌体处于稳定生长期镜检部分菌体呈链状排列。1.6.3生理生化特征：需氧性V-P试验过氧化氢酶反应淀粉水解反应明胶水解反应酪素水解反应糖发酵试验和耐盐性试豆芽孢杆菌比较。九株芽孢菌生理生化与N1型比较十十十十十十十十(产酸不产气)甘露糖甘露糖7%氯化钠：十十十7%氯化钠：10%氯化钠：9十+十十十十硝酸盐还原十十十十十十十十十1.7菌株复筛:1.7.1粗酶液制备：初筛菌株接种于种子培养基，37℃180r/min16h,得种子悬液,以2%接种量接入发酵培养基中，相同条件下培养24h将菌液10000r.min离心10min除去菌体，收集上清液-80℃保存备用。1.7.2蛋白酶活力的测定：按国标执行1.7.3传代稳定性测定：将复筛的纳豆芽孢杆菌接种到斜面,24h传一代，连传十代，测定不同代数菌株48小时发酵液中蛋白酶的活4.芽孢杆菌属菌株筛选及相关研究(南海所)4.1培养基：对虾饲料2g/L(研成末)4.2实验菌株：养殖池塘中分离150株菌株，淡水鱼塘分离到50株4.3菌株筛选4.3.1初筛：斜面使用前活化，分别划线于平板，28-30℃培养48h,大部分菌株不长或生长缓慢，其中56株生长旺盛，作为二筛菌株。4.3.2二筛：接种于液体培养基上，28-30℃培养48h,80℃水浴5min,检测观察大部分菌株死亡，有10株存活。4.3.3三筛：将10株存活菌划线于平板，观察8株生长旺盛，挑取进行芽孢染色，发现均为芽孢杆菌菌株。将8株进行保存，进行酶活降解有机物能力致病性测定。4.3.48株芽孢菌淀粉酶蛋白酶活力测定(平板透明圈大小):淀粉酶活力：观察淀粉培养基(肉汤蛋白胨加0.2%可溶性淀粉)上菌落透明圈大小排列。一般1.0-4.0厘米。蛋白酶活力：观察在酪素培养基上菌落透明圈大小排列。一般通过对两种平板透明圈的比较，其中四株具有较高淀粉酶和蛋白酶活力，作为进一步研究的菌株。还有一株淀粉酶活力较弱，蛋白酶活力较强。可与其他菌株搭配使用，故对5株菌株进行研究，作为降解★★5.产蛋白酶枯草芽孢的复壮及初步研究5.1培养基：筛选培养基：牛肉膏3g/L酪素10g/LNaCl5g/LPH7.2-7.4.种子培养基：蛋白胨10g/L牛肉膏5g/LNaCl5g/LPH7.2-7.4.发酵培养基：豆饼粉3%玉米粉3%麸皮2.5%K2HPO40.5g/LNa2HP5.2菌株筛选：初筛：依据水解圈的大小，选择平板D/d较大的菌株，该菌株具有较强繁殖能力和分解酪素能力。复筛：挑取菌株划线分离至纯培养，然后摇瓶复筛。斜面30℃培养48h后，接种于100mL/500mL三角瓶中，30℃180r/min18h,在按2%接种量接种于发酵培养基上，30℃180r/min24h.取发酵液4000r/min离心得菌株粗酶液，测酶活力，由1392u/ml提高到1756u/ml。复壮后菌株生长速度、繁殖能力和代谢能力均有不同提高。液体摇瓶培养生长曲线：液体菌种按2%接种于牛蛋液体培养基中(100mL/500mL)30℃180r/min培养,定时取样测定OD600值，该菌株6h达到对数期，18h达到稳定期，24h达到衰退期。发酵罐培养:50L发酵罐培养，2%接种量30℃18h前通风量24018-24h通风量改为300Lmin.m3有利于产酶进行，粗酶液酶活力9411u/ml.6.产淀粉酶芽孢杆菌高产菌株的筛选6.1选育菌株：枯草6株地衣1株蜡样2株凝结1株6.2培养基：淀粉培养基:可溶性淀粉10g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/LNaCl种子培养基：可溶性淀粉5g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/LNaCl发酵培养基：豆饼粉1.5%玉米粉2%NaCl2.5g/LK2HPO42g/LNa2HP042g/LMgS040.2g/L柠檬酸钠2.0g/L硫酸铵0.75g/L氯化钙6.3菌株筛选：初筛：菌种活化：接种于营养肉汤培养基，37℃12h,菌液点接于淀粉培养基培养2-3天，革氏碘液染色，菌落周围透明圈。用游标卡尺测量圈的直径菌落直径，决定酶活力的高低。复筛：制备粗酶液：活化菌株接种于种子培养基中，37℃12h,然后以5%接种量接种发酵培养基中，37℃160r/min48h,发酵24h后补加0.02%碳酸钙，4000r/min离心20min得上清液为菌株粗酶液，测酶活力。注：虽透明圈大小反映酶浓度的高低，但不完全代表菌株产酶能力。原因多样固体液体培养条件不同，菌苔大小及在平板上堆积情况的差异，不同菌株具有不同生长和产酶速度及淀粉酶酶系等。故液体复筛必不可少。7.高产淀粉酶蛋白酶枯草芽孢杆菌筛选及鉴定7.1菌株来源：科研部门提供和从水体中分离纯化筛选几株菌株。7.2培养基：种子培养基：蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1.0g/LK2HPO43g/L产酶培养基：蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1.0g/L可溶性淀粉6.3粗酶液制备：各菌种接种于60mL/250mL种子培养基活化后，接种于产酶液体培养基，30℃120r/min20h,4000r/min离心15-20min,取上清液于4℃冰箱保存备用。8.土壤中淀粉酶产生菌的筛选及其发酵条件研究8.1培养基和试剂8.1.1淀粉培养基：分离筛选用8.1.2检测试剂(路戈氏碘液)碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300mL。配制方法：先用少量(3-5mL)蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘片，待碘片完全溶解后，加水稀释至300mL,于棕色瓶内备用。8.2菌株分离与筛选初筛实验中，以菌落周围形成水解圈直径的大小作为淀粉酶活力的初步判定的依据，水解圈大的，淀粉酶的活力就大。菌种分离：初筛：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。取10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取0.1mL悬液，均匀涂布于淀粉培养基平板上，于30-37℃培养36-48h,根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。同时，将检测试剂(路戈氏碘液)加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号,以便进行复筛。共得到52株淀粉酶生产菌，其水解圈直径从0.5mm到27mm,其中活性较强的细菌有6株。将这6株菌进行复筛，用分离培养基液体培养基发酵培养2d离心后，用检测培养基打孔检测其上清液，8h后测得水解圈直mm的菌株为NMXY-3,因此选取NMXY-3号菌株作为目的菌株目的菌株在分离平板上形成水解圈复筛：在初筛中分离到的产淀粉酶的菌株活化后接入装有分离培养基液体培养基的三角瓶中，30-37℃摇床发酵培养48h,发酵液4000rpm离心10min,取上清液。在检测培养基上打孔后,将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置8h后取出，用路戈氏碘液加入到平板中，涂布均匀，水解圈大的其发酵液上清中的淀粉酶的活性就高，取活性最高的菌株作为目的菌株，对其进行发酵条件实验。(在测定发酵液中淀粉酶的活性时，采用检测检测培养基打孔法进行测定，其实质是检测的单位体积发酵液上清液的淀粉酶的活性。将发酵液4000rpm离心10min,取上清液。在检测培养基上面打孔后，将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置8h后取出，把路戈氏碘液加入到平板中，涂布均匀，量取水解圈的直径并进行数据分析。此方法的注意以下操作：在倒平板时,应使同一平板和不同平板培养基的厚度一致，培养基的表面要平。加入的上清液的量要一致。否则就会影响实验结果。其原理是根据淀粉酶的活性与其形成的水解圈的直径之间虽然不完全成正比，但成正相关,水解圈的直径越大，其活性就越高)8.3发酵条件的优化取淀粉酶活性最强的菌株作为研究对象，对其最佳的发酵条件进行在发酵条件中，选取了培养基的初始pH值、培养温度梯度、碳源、氮源、金属离子等指标进行发酵实验。7种培养基的初始pH值、5种碳源、3种氮源、5种金属离子等用相应的培养基，培养温度梯度实验用分离培养基液体培养基在不同的温度4种温度下培养。每个指标做3个重复，取平均值。培养2d后，取发酵液，8000rpm离心5min,取上清液。在检测培养基上面打孔后，将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置8h后取出，把路戈氏碘液加入到平板中，涂布均匀，量取水解圈的直径并进行数据分析。8.4NMXY-3号菌株的初步鉴定对此菌株于牛肉膏蛋白胨培养基培养18h后，挑取少量菌体作涂片后用结晶紫染色后，用光学显微镜油镜观察,其菌体呈球状，及其生理特征初步判定其为一种双球菌，NMXY-3。图2目的菌株在油镜下的形态(1000倍)在产生淀粉酶的细菌中，研究较多的有枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等杆菌类，而该淀粉酶产生菌为双球菌。9.枯草芽孢杆菌的分离与鉴定微生态制剂(芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和光和菌等的混合或单一制剂)广泛应用于饲料工业添加剂的开发、水产养殖、水质净化和病虫害的防治，这类产品的应用极大地改善了畜牧业及渔业的产品品质，减少或避免了使用一些副作用较大的农药。随着生态环境日益恶化，养殖生产中用药量不断参加，其后果影响了水产品安全和产业的可持续发展。很多发达国家已制定严格的农产品进口检验标准，大幅降低农药和抗生素的残留量，用微生物制剂改善养殖水体微生态环境也受到人们越来越多的关注改善。养殖水体微生态环境的改善是多种微生物共同作用的结果,能更有利于吸收、分解S02、恶臭味的有害气体。同时，这些微生物又可以产生无机生活的酸性环境，并从根本上降解分解时产生恶臭气体的物质。若能将来源丰富、污染环境的水产废弃物,经过无公害化处理转化为种植业所急需的有机肥，则既可以增加经济效益,,又能改变粪便堆积、臭气挥发的状态。水产腐生质中存在着多种微生物，其中枯草芽孢杆菌具有净化水质的水产腐生质中分离出枯草芽孢杆菌,为研究改善菌群打下基础，同时为枯草芽孢杆菌在养殖水质的供参考。作用。本实验拟在水体问题的混合生态调控应用提枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7-0.8×2-3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时,常形成皱酸。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5’-核苷酸酶的菌种。广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中,易在枯草浸汁中繁殖，故名。9.2.研究内容及方法：9.2.1菌种分离材料：水产腐生质(由多种未知菌群组成)9.2.2实验培养基：LB培养基：酵母膏5g胰蛋白胨10g氯化钠10g水1000ml琼脂粉2%PH7.6TSA培养基：葡萄糖2.5g磷酸二氢钾2.5g氯化钠5g大豆蛋白胨3g蛋白胨17g水1000ml琼脂粉2%PH7.6吲哚试验培养基：蛋白胨10g氯化钠1g蒸馏水1000mlPH7.6Ehrlich氏试剂：对位二氨基苯甲醛1g,无水乙醇95ml,浓盐酸20ml,先用乙醇溶解试剂后加盐酸，避光保存.微量生化反应管：葡萄糖产气实验枸橼酸盐试验产H2S实验产氨实验等9.2.3实验准备菌种分离材料--实验培养基--微量生化反应管--实验器材9.2.4细菌的初步分离及纯化取少量水产腐生质溶解于50ml蒸馏水中，可调移液枪吸取200μl上层清液平铺于培养基，并用经酒精灯火焰消毒的铂尔丝将液体均匀涂布于培养基上，入恒温箱培养24h后观察平板上的菌落，挑取疑似枯草芽孢杆菌菌落并制作菌落涂片。取一滴蒸馏水置于载玻片上，用接种针挑取菌落在蒸馏水中涂布。制作的涂片自然干燥并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行革兰氏染色，于100倍油镜下观察并记录菌株的个体特征。保留革兰氏阳性菌，不断挑取单个菌落进行划线及保存,直到得到纯净的单一菌落。9.2.5细菌的生化鉴定9.2.5.1氧化型与发酵型·用灭菌牙签取单菌落接种到明胶微量生化反应管，37℃培养24h,观察结果并记录。在有氧条件下称为氧化,无氧条件下称为发酵。这对区别微球菌与葡萄糖菌、肠杆菌科成员中尤其9.2.5.2糖类分解实验·取某一细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化反应管内,37C培养24h,观察结果并记录。若细菌分解糖则产酸或产酸或产气,使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。9.2.5.3硫化氢试验·取一种细菌纯培养物，接种于H2S微量发酵管中，置于37C培养24h后，观察结果。培养液呈黑色者为阳性,以“+”表示，无色者为阴性，以“-”表示。9.2.5.4枸橼酸盐利用试验·取纯培养细菌接种于西蒙氏枸橼微量生化反应管内，置于37C培养48-72h,培养基由草绿色变为深蓝色为阳性，否则为阴性。肠杆菌、酸杆菌和一些沙门氏菌种产生阳性反应，可见菌体生长良好或培养基显为深蓝色。9.2.5.5吲哚(靛基质)试验将一小指大的脱脂棉，滴上两滴Ehrlich氏试剂，再在同一处加滴两滴高硫酸钾(K2S208)饱和水溶液,置于含培养液的被检试管中，离液面约1.5cm,将被检试管放入烧杯或搪瓷缸