SN∕T 3507-2013 进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 PCR法和实时荧光PCR法-PDF解密-PDF解密

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3507—2013进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法Identificati0n0fcashmereandw00lintextilesf0rimp0rtandexp0rt—PCRmeth0dandreal-timeflu0rescencePCRmeth0d2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局ISN/T3507—2013本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。1SN/T3507—2013进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法1范围本标准规定了纺织品中山羊绒、绵羊毛鉴别的PCR和实时荧光PCR方法。本标准适用于纺织品中山羊绒、绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCR一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性—退火—延伸的循环反应，使极少量的DNA的特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。3.2实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethre松hold）DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）DTT:二硫疏糖醇。5原理用试剂盒法提取样品DNA。针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针，通过单一PCR、实时荧光PCR技术，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判定该样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。2SN/T3507—20136试剂6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。6.2组织和毛发提取试剂盒（与DNAIQTM系统结合使用）:参见附录A中A.1。1）6.32XTaqPCRMasterMix:0.1U/μLTaqDNA聚合酶，500μmol/LdNTP，20mmol/LTris-HCl（PH8.3100mmol/LKCl，3mmol/LMgCl2，其他稳定剂和增强剂，—20节保存。6.4premi工E工TaqTM（PerfectRealTime2X）:见A.2。6.595%或100%乙醇。6.6琼脂糖。6.7溴化乙锭。6.8DNAmarker。6.9TE溶液（PH8.0）。6.105XTBE缓冲液。7仪器与设备7.1冰箱:4节~—20节。7.2天平:感量0.001g。7.3分析研磨机。7.4剪刀。7.5微孔干浴器或水浴锅。7.6瞬时离心机。7.7涡旋仪。7.81.5mL磁分离架。7.9微量可调移液器及枪头:10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。7.101.5mL离心管。7.11PCR薄壁管。7.12实时荧光PCR光学反应管。7.13超净工作台。7.14PCR仪。7.15实时荧光定量PCR仪。7.16电泳装置。7.17凝胶成像仪。8取样纱线:从不同的管纱、筒纱或绞纱上随机取样，共取约1g的纱样。织物:从不同位置剪取，共取约1g的织物。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3SN/T3507—20139制样用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散、混匀，再用剪刀尽量剪碎至纤维长度2mm~3mm，再次用分析研磨机混匀。10DNA的提取10.1称取约5mg试样，放入1.5mL离心管中，每个样平行提取2管，加100μLDTT（1mol/L）和75μL蛋白酶K储存液，混匀，56节温浴过夜。10.2加350μL裂解液，上下颠倒混匀，瞬时离心，将上清液移至新的1.5mL离心管中。10.3加7μL完全悬浮的DNAIQTM树脂，高速涡旋振荡3s，室温放置10min。10.4将离心管高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上。10.5待磁珠完全吸附至管壁后，小心吸去溶液，加入100μL裂解缓冲液，高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上。10.6吸去裂解液，加入100μL1X洗涤液，高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上，加100μL洗液重复洗涤3次，尽可能吸尽最后一次的洗涤液。10.7打开盖子，风干5min。10.8加入70μL洗脱液，高速涡旋振荡2s，65节温浴5min。10.9取出离心管，高速涡旋振荡2s，置于磁分离架上，小心吸取溶液（即DNA溶液）于新的1.5mL离心管中，—20节保存备用。11DNA的鉴别11.1质量控制进行PCR、实时荧光PCR鉴别时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：扩增山羊成分时用山羊绒DNA，扩增绵羊成分时用绵羊毛DNA。阴性对照：扩增山羊成分时用非山羊绒DNA，扩增绵羊成分时用非绵羊毛DNA。空白对照：实验用水。11.2PCR法所用引物信息见表1，用TE溶液（PH8.0）稀释至10μmol/L，—20节保存备用。表1PCR扩增所用引物扩增成分引物名称引物序列退火温度节产物大小内参基因Cyt-FCyt-R5，-GCG/ATACGCAATCTTACGATCAA-3，5，-CTGG/TCCTCCAATTCATGTGAG-3，54195山羊12SG-F12SG-R5，-CGCCCTCCAAATCAATAA-3，5，-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3，543304SN/T3507—2013扩增成分引物名称引物序列退火温度节产物大小绵羊12SS-F12SS-R5,-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-3,5,-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3,5217411.2.2PCR反应体系2XTaqPCRMa松terMix12.5μL，10μmol/L引物各0.5μL，DNA模板5μL，ddH2O6.5μL。11.2.3PCR反应条件注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。11.2.4PCR产物的检测将适量5XTBE稀释成0.5XTBE溶液，配制2.0%琼脂糖凝胶。取15μLPCR产物，点样进行电泳，并加DNAmarker点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm~5V/cm长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液（10μg/μL）中浸泡30min。用凝胶成像系统观察、拍照、记录与分析电泳结果。11.2.5PCR结果及判断阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品未出现预期大小的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一步确证。11.2.6结果确证实验可疑阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与附录B中的相应序列进行比对，同源率达100%，可确证为阳性结果，或采用实时荧光PCR法进行确证。11.3实时荧光PCR法11.3.1引物及探针所用的引物、探针见表2，用TE溶液（pH8.0）稀释至10μmol/L，—20节保存备用。表2实时荧光PCR所用引物、探针扩增成分引物名称引物序列退火温度节产物大小内参基因12S-F12S-R12S-P5,-AAAGGACTTGGCGGTGCTT-3,5,-GGGTTTGCTGAAGATGGCG-3,5,-FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCG-TAMARA-3,601715SN/T3507—2013扩增成分引物名称引物序列退火温度节产物大小山羊12SG-F12SG-R12SG-P5,-CGCCCTCCAAATCAATAA-3,5,-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3,5,-FAM-ACGTGTTAAAGCACTACATC-TAMARA-3,54330绵羊12SS-F12SS-R12SS-P5,-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-3,5,-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3,5,-FAM-AAACCAAGATATAGCTTAATT-TAMARA-3,5217411.3.2PCR反应体系premi工E工TaqTM（PerfectRealTime2X）12.5μL，10μmol/L引物、探针各0.75μL，ROXReferenceDyeⅡ（50X）0.5μL，DNA模板5μL，ddH2O4.75μL。注：ROXReferenceDyeⅡ（50X）适用于ABI7500、7500Fast实时荧光PCR系统，其他型号的荧光PCR仪请参照说明书操作。11.3.3PCR反应条件95节，30s；95节，5s，退火温度（表235注：不同仪器可根据仪器要求和premi工E工TaqTM（PerfectRealTime）使用说明书将反应参数作适当调整。11.3.4结果分析反应结束后，应设置无效基线范围。基线范围选择在3~15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值—40为准。设置阈值后，分析样品的检测结果。11.3.5结果判断待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在20~30之间者，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值小于或等于36，内参照基因检测Ct值在20~30之间者，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值在36~40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分；再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。6SN/T3507—201311.4结果表述11.4.1未检出山羊绒、绵羊毛。11.4.2检出山羊绒、绵羊毛。12防止污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施参照GB/T19495.2。7SN/T3507—2013附录A（资料性附录）试剂盒及试剂A.1组织和毛发提取试剂盒（与DNAIQTM系统结合使用推荐使用promega公司产品）50mL蛋白酶K（proteinaseK）100mg二硫疏糖醇（DTT）5.0g2X洗涤缓冲液（washbuffer）30mL40mL15mL0.9mLA.1.2试剂配制A.1.2.1蛋白酶K储存液向冻干的蛋白酶K瓶中加入5.5mL温育缓冲液，轻摇使之完全溶解。此蛋白酶K储存液的终浓度为18mg/mL。将蛋白酶K储存液分装成小包装，可在—20节保存至1年，反复冻融不要超过5次。使用前将蛋白酶K放置在冰上融化及保存。A.1.2.21mol/LDTT将5gDTT溶于无核酸酶的水中至终体积为32.4mL，则DTT的终浓度为1mol/L，分装成小包装使用并保存在—20节。A.1.2.31x洗涤缓冲液向2X洗涤缓冲液中加入15mL95%~100%的乙醇和15mL异丙醇，混匀，室温保存。A.1.2.4裂解液确定所需的裂解液的总量，每100μL裂解缓冲液中加入1μL1mol/LDTT，颠倒几次混匀，室温保存一个月。A.2premixExTaqTM（perfectRealTime2x）试剂盒组成premi工E工TaqTM（perfectRealTime2X）1.0mLX5支ROXReferenceDye（50X）200μLX1支8SN/T3507—2013ROXReferenceDyeⅡ（50X）200μLX1支A.30.5mol/LEDTA（PH8.0）在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的PH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌。A.45xTBE缓冲