小鼠草酸钙肾结石模型建立的初步探索

小鼠草酸钙肾结石模型建立的初步探索

摘要：目的探索一种简便、成石效果好的小鼠草酸钙肾结石模型。方法采用1%乙二醇自由饮水法增加小鼠尿草酸和/或腹腔注射10%葡萄糖酸钙增加尿钙排出量，比较小鼠24小时尿草酸（Ox）、尿钙（Ca2+）、过氧化氢H2O2、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛（MDA）含量，观察肾草酸钙结晶形成情况，免疫组化法观察CD68蛋自在肾脏中的表达位置并用灰度值法计算其表达水平，评价小鼠草酸钙肾结石造模效果。结果单独诱导高草酸尿或高钙尿的小鼠肾内氧化应激指标增高和巨噬细胞浸润增多但未见结晶，同时介导高草酸尿和高钙尿的小鼠肾内氧化应激损伤指标增高和巨噬细胞浸润增多且有较多结晶。结论单独诱导高草酸尿和高钙尿不足以使小鼠肾内生成结晶，同时诱导高草酸尿和高钙尿成石效果好，巨噬细胞可能在肾结晶形成和/或清除中起到重要作用。关键词：草酸钙；肾结石；动物模型；小鼠泌尿系结石草酸钙大鼠动物模型肾结石是一种常见疾病，其中草酸钙结石居多。因此实验动物草酸钙结石模型是肾结石基础与临床研究的重要方法。目前国内主要通过乙二醇饮水法介导大鼠草酸钙肾结石模型[1]。用小鼠诱导草酸钙肾结石模型比较少见。目前认为，小鼠较之于大鼠肾结石形成有较高的耐受性，草酸钙晶体形成几天后即被清除[2]。因此建立一个成石效果好，且简便，经济的小鼠草酸钙肾结石模型并研究小鼠肾内一些结石相关的指标变化及结晶清除机制，对研究肾结石的形成机制和指导临床治疗有重要的意义。1材料1．2试剂与仪器乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）测试盒，南京建成生物工程研究；CD68兔抗小鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；乙二醇(分析纯，天津市化学试剂一厂)。2550型紫外一可见光分光光度计(日本岛津公司)；病理图像分析仪（德国莱卡公司），离子色谱仪（德国DIONEX公司）；自动生化分析仪（美国雅培公司）；LAMBDABIO20双光束紫外分光光度计（美国PE公司）；7170A自动生化分析仪（日本日立公司）JAl203型电子天平(上海天平仪器厂)。1．2动物昆明小白鼠40只，雄性，体重18～23g，由广西医科大学实验动物中心提供。2方法2．1动物分组及给药方法动物饲养1周后，选体重20-25g昆明小白鼠随机分为4组，每组10只，正常颗粒饲料喂养。造模A组：1％乙二醇饮水；造模B组：1％乙二醇+10％葡萄糖酸钙，ip2mL/kg·d；造模C组：10％葡萄糖酸钙，ip2mL/kg·d造模D组：正常饮水。各组小鼠均在相同的条件下饲养。造模共8周。2．2观察指标及检测方法实验结束前用代谢笼收集并测24h尿量以及用于检测尿草酸（离子色谱法）、尿钙（自动生化分析）、过氧化氢、乳酸脱氢酶、丙二醇的浓度。脱颈椎处死小鼠，切取小鼠的双肾，观察其外观改变，右肾置10％中性福尔马林中固定，作常规HE石蜡切片和VonKossa染色及免疫组化，左肾精密称重后计算各组大鼠的左肾/体重比值。2．3统计学分析实验数据以X±S表示，用SPSS16．0统计软件分析。计量资料组间比较用One．WayANOVA方差分析，LSD用于比较组内差别。P<0．05为差异有统计学意义。3结果3．1动物存活情况各组至实验结束均无动物死亡。3．2各组小鼠24h尿草酸、钙离子、左肾/体重比值与D组比较，饮用了乙二醇的A、B组尿草酸排泄量显著增加，但两者之间无显著差异（P>0.05）；而腹腔注射了葡萄糖酸钙的B、C组尿钙排泄量显著增加，但两者间无显著差异（P>0.05）；与D组比较，B组肾脏/体重比值高于D组（P<0.05）。表2.各实验组客观指标H2O2、MDA、LDH的表达Ox（mg/ml）Ca2+（mmol/ml）左肾体重比值A组0.0671±0.0067#0.0770±0.007180.00777±0.00111#B组0.0637±0.0105#0.2551±0.01401#0.00783±0.00102#C组0.0161±0.0036#0.2718±0.01415#0.00504±0.0007D组0.0190±00420.0789±0.00690.00643±0.00165“#”代表与空白组比较，P<0.053．3各组小鼠24h尿乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量与D组比较，运用了药物干预的A、B、C3组尿H2O2、LDH浓度显著增加，但三者之间无显著差异（P<0.05）；A、B2组尿液MDA、显著增高（P<0.05）。表2.各实验组客观指标H2O2、MDA、LDH的表达。H2O2（mmol/ml）MDA（nmol/ml）LDH（U/L）A组49.61±6.345#1.787±0.417#867.83±156.80#B组51.803±6.289#1.603±0.495#905.26±174.42#C组