血清（浆）类固醇激素液相色谱串联质谱检测质量保证专家共识

血清(浆)类固醇激素液相色谱-串联质谱检测质量保证专家共识【摘要】液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)在人体血清(浆)类固醇激素检内医学实验室开展血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测多参考已发表学术论文和仪器厂家说明书提供的通用操作和检测程序。然而，血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测的技术难度大，临床实验室检验人员大多数缺的临床应用。为规范我国血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测，共识从检验前、测项目提供参考，以推动我国血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测的临床应用生理功能可分为肾上腺皮质激素(糖皮质激素、盐皮质激素)、性激素(雌激素、雄激素、孕激素)及维生素D[1],在人体生长发育、能量代谢、免疫调节、生育功能调节等方面发挥重要作用。血清(浆)类固醇激素异常与先天性肾上腺育延迟或性早熟等多种内分泌疾病密切相关[2],因此其检测广泛应用于多种但特异性相对不足，且线性范围窄，难以实现精准检测。液相iquidchromatography-tandemmassspec及中间代谢产物，是目前精准、全面定量分析血清(浆)类固醇激素的首选方法优化[5-6]、生物参考区间建立[7]等，国外已有针对血清(浆)雄激素、雌激素LC-MS/MS检测程序的指南[8],国内有LC-MS/MS临床应用通用建议共识及25羟-维生素D和雄激素LC-MS/MS检测的共识[9-11],但依然缺乏基于此，为规范我国血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测，中国质谱学会临床质量保证进行详细说明并提出建议，为实验室开展血清(浆)类固醇激素检测项目提供参考，以推动我国血清(浆)类固醇激素检测的临床应用和结果一致性，一、血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检验前质量保证(一)标本采集荐给标本采集人员和患者。例如：皮质醇分泌通常在清晨6:00—8:00达到峰对固定[12];醛固酮仰卧位采血比直立位采血检测结果低50%[13];女性患者进行血清(浆)雌激素检测时需明确卵泡期、黄体期等信息，对于无规律月经周期女性，需明确绝经(特别是早绝经)原因，如自然绝经、外科手术、辐射、药物作用等[14-15]。体积和储存时间也可不同程度影响检测结果[16]。新生儿CAH二级筛查中，EDTA采血管可导致17α-羟孕酮、雄烯二酮及11-脱氧皮质醇的LC-MS/MS检测结果偏高，造成假阳性[17]。另外，更换采血管品牌或批号也可能影响待测睾酮水平，卵泡期采血检测雌激素水平。推荐采用不含分离胶的血清(浆)采(二)标本保存和运输实验室应根据类固醇激素质谱检测的标本保存条件及检测频率进行标本的稳定性验证[18]。标本稳定性验证实验应至少包括环境温度、冷藏和/或冷冻稳定性实验均需使用新鲜血清(浆),通过比较新鲜采集和保存后的血清(浆)标本检测结果评估其稳定性。建议2实验室应根据标本保存的实际需求，使用新鲜标本对来自文献报道或试剂说明书的标本稳定性进行验证，或自建稳定性可接受的标本保存条件。建议血清(浆)标本中类固醇激素稳定保存的条件及时间见表1。建议稳定保存时间常温(20℃)冷藏(4°℃)冷冻(-20℃)11-脱氧皮质酮血皮质醇(游离和总皮质醇)17α-羟孕酮17α-羟孕烯醇酮11-脱氧皮质醇(一)标本前处理标本前处理方法取决于待测物的理化性质、灵敏度要求和分析方法。其目的是将待测物从血清(浆)及其他潜在干扰物质中分离、提取、纯化，并实现对待测物的浓缩。大多数糖皮质激素(如17a-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇、可的松)和盐皮质激素(如孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质酮、皮质酮)为疏水结构，均可与相应转运蛋白结合存在于血液中，游离形式约占1%。但血液中，约50%醛固酮以游离形式存在。睾酮和雌二醇与白蛋白结合力弱，与性激素结合球蛋白(sexhormonebindingglobulin,SHBG)结合力强，2%~4%睾酮呈游离形式，60%~75%睾酮与SHBG结合，20%~40%睾酮与白蛋白结合[1]。硫酸雌酮在提取之前需通过水解酶获得游离型雌酮。亲脂性性激素(雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、雌酮、雌二醇、雌三醇)较亲水性性激素(硫酸脱氢表雄酮、ofquantification,L0Q)。血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测的标本前处理流程通常包括：(1) (4)纯化[19]。对易氧化的类固醇激素，前处理时需尽可能避免发生氧化以防待测物降解及产生干扰物。例如，在样品浓缩时使用惰性气体(如氮气),而与待测物具有相似结构和离子化性质的同位素标记物(或结构类似物)作为类固醇激素LC-MS/MS检测内标物，例如氘代或13C标记的类固醇。待测物大3,氘代或13C标记数量控制在7,化学纯度应≥98%,同位素内标物纯内标物需加入到所有校准品、质控品和待测标本中，且应在提取或纯化步骤之前或同时加入。加入内标物后需静置足够长的时间(通常15~30min)以平衡内标物与结合蛋白的相互作用，抵消因蛋白结合导致的检测浓度偏低，如睾酮和睾酮-d3需30min完成平衡(22℃)。内标物的质谱信号强度应在不同分析批次中保持稳定，平衡时间不足可能会导致内标物信号强度不稳定。建议3使用与待测物有相同理化性质的商品化同位素标记物作为类固醇激素LC-MS/MS检测内标物(表2),浓度设置在校准曲线的中浓度或医学决定水平附近，实验室应制定内标物信号强度波动的批间可接受范围。表2类固醇激素内标物分析物内标物醛固酮醛固酮-d、孕酮孕酮-d。孕烯醇酮11-脱氧皮质酮脱氧皮质酮-d.皮质酮皮质酮-d,皮质酮皮质醇-d₂17α-羟孕酮17α-羟孕酮-d₄17α-羟孕烯醇酮17a-羟孕烯醇酮-C₂-d21-脱氧皮质醇-d,11-脱氧皮质醇11-脱氧皮质醇-d可的松可的松-d。雌酮雌二醇-d,雌三醇-d,雄烯二酮睾酮睾酮-C₃双氢睾酮脱氢表雄酮脱氢表雄酮-d。硫酸脱氢表雄酮硫酸脱氢表雄酮-d。血液中存在的大量蛋白质、多肽、小分子化合物等可引起LC-MS/MS的离子MS分析前应提取待检测物，去除无机化合物(如盐)、蛋白质、脂质(如甘油三酯)和磷脂等物质的干扰，提高检测灵敏度、重复性和稳定性。LC-MS/MS分析标本的提取方法包括蛋白沉淀(proteinpr需要消耗大量有机溶剂，故临床常用固相支撑液液萃取(supportedliquidextraction,SLE)替代传统LLE,降低有机溶填料(通常填充于小柱型装置中)对样品不同组分进行化学分离，较SLE具有更或吹干提取物后用不同溶剂重新提取。其中，通过高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)可在线进行SPE谱，提高色谱分离效率和检测灵敏度，使血清(浆)标本无需或只需经简单蛋白(二)类固醇激素LC-MS/MS定量分析数的分离技术。通常使用对非极性分子具有高亲和力的非极性固定相(如18C、五氟苯基等)色谱柱分离类固醇激素[20],通过流动相极性变化将吸附于色谱动相梯度洗脱程序和使用适合的色谱柱可以分离结构非常相似的类固醇激素及其代谢物，包括一些同分异构体(如21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇)。通流动相中通常加入挥发性添加剂(如0.01mol/L甲酸铵、0.1%甲酸),其浓度不应超过0.5%,以增强化合物离子化，而不应含非挥发性流动相添加剂。色谱柱后进行日常冲洗程序，并最终将色谱柱保持在95%及喷雾电离(electrosprayionization,ESI)和大气压化学电离(atmospheric11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、可的松、睾酮、孕酮、17a-羟孕酮、皮质的类固醇激素，如3β-羟基-5-烯类固醇[21],在需同时检测多个类固醇行分离，并采用多反应监测(multiplereac应监测(selectedreactionmonitoring,SRM)模式采集数据。最终借助质量分析器选择特定母离子和子离子，通过母离子/不完全相同，每个化合物通常选择2个离子通道(表3)。基于定性离子、化合物极性及内标物分离峰综合判断目标化合物的3.LC-MS/MS测量程序性能验证和/或确认：测量程序的性能要求取决于其童血清睾酮，测量程序的灵敏度需要达到0.02ng/ml;同时检测浓度差异大的多个分析物，如雌二醇、雌酮、雄烯二酮，需验证测量程序对每个分析物的分析性能是否满足临床需求。值得注意的是，由于血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量程序包含的人工操作步骤多，各实验室环境条件、仪器设备配置、人员水平相差大，因此即使实验室使用商品化试剂盒(I、Ⅱ类),也应进行性能确认或验证。LC-MS/MS测量程序性能验证和/或确认程序可参考共识[22]或美国临床和实验室标准协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)C62-A[23],并根据生物变异、临床指南、政策法规等设定性能验证中每项参数的可接受标准。 电离模式碰撞能量(V)透镜电压(V)11-脱氧皮质酮17a-羟孕酮17a-羟孕烯醇酮11-脱氧皮质醇(三)类固醇激素LC-MS/MS测量程序的分析性能指标类固醇激素相关疾病的临床诊断对检测指标及灵敏度有不同需求，实验室应综合临床需求及仪器灵敏度确定LC-MS/MS测量程序分析性能。1.肾上腺皮质激素：皮质醇是最主要的肾上腺皮质激素(约占75%~95%),血液中总皮质醇、游离皮质醇水平及昼夜节律变化常用于辅助诊断原发性和继发性肾上腺功能不全、库欣综合征、艾迪生病。正常成人清晨血清总皮质醇浓度通常在20~50ng/ml,经平衡透析后的游离皮质醇浓度约占总皮质醇5%,可更准确反应皮质醇水平及节律，推荐检测血清(浆)游离皮质醇(LOQ≤1ng/ml)。皮质醇联合17a-羟孕酮、雄烯二酮常用于筛查11-羟化酶或21-羟化酶缺乏型由21-羟化酶基因变异导致，患者血清雄烯二酮水平通常升高5~10倍，17a-羟孕酮水平升高幅度更大，而皮质醇水平较低或无法检测。不同年龄、性别人群17a-羟孕酮及雄烯二酮水平差异较大，推荐实验室检测17a-羟孕酮(L0Q≤0.1ng/ml),检测区间上限设定在参考区间上限10倍以上[24]。硫酸脱氢表雄酮、孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质酮和18-羟皮质酮常用于已排除11-羟化酶、21-羟化酶缺乏型CAH,及确认3β-羟基类固醇脱氢酶缺乏和17a-羟化酶缺乏型CAH。在非常罕见的17a-羟化酶缺乏症中，雄烯二酮、所有雄激素前体(17a-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮、硫酸脱氢表雄酮)、睾酮、雌酮、雌二醇和皮质醇水平降低，而盐皮质激素(孕酮、11-脱氧皮质酮和18-羟皮质酮)水平明显升高。醛固酮是典型的盐皮质激素，常用于辅助诊断原发性醛固酮增多症(如肾上腺肿瘤、肾上腺皮质增生)和继发性醛固酮增多症(如肾血管疾病、盐耗竭、钾负荷、肝硬化腹水、心力衰竭、妊娠、Bartter综合征),以上情况醛固酮水平通常可升高10~100倍。因此，建议醛固酮L0Q≤0.02ng/ml,检测区间上限设定在参考区间上限100倍(表线性范围(ng/ml)定量限(ng/ml)精密度(%)准确度(%)睾酮17α-羟孕酮17a-羟孕烯醇酮2.雄激素：LC-MS/MS较易检测正常成年男性雄激素水平，但对低雄激素水平人群，如女性、儿童以及性腺功能减退的男性，则要求测量程序具有更高的灵敏度。对成年女性，睾酮水平通常用于评估由肾上腺合成异常和PCOS导致的高女性或儿童的睾酮测量程序L0Q≤0.02ng/ml,并需配置高灵敏度LC-MS/MS系代治疗或5a-还原酶抑制剂疗效，建议采用双氢睾酮非衍生化法LC-MS/MS检测(L0Q≤0.05ng/ml)。雄烯二酮还可用于女性高雄激素血症等疾病中，雄烯二酮水平明显升高，但在3β-羟基类固醇脱氢酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症及类固醇合成急性调常1~8岁儿童<2ng/ml),为了准确诊断儿童肾上腺功能初现、性早熟，建议脱氢表雄酮L0Q≤0.02ng/ml,硫酸脱氢表雄酮L0Q≤30ng/ml。硫酸雌酮在体内的浓度是雌二醇和雌酮的10~50倍，且半水平，建立分析性能满足要求的类固醇激素LC-MS/MS测量程序(表4)。(四)类固醇激素LC-MS/MS测量程序的质量保证量结果的量值能够与规定的参考标准(国家或国际计量标准)联系起来[28]。及中国合格评定国家认可委员会关于测量结果的计量溯源性文件要求建立计量溯源链，核心要素包括被测物、参考物质、校准及赋值程序、测量结果验证[2文件明确被测物属性，包括分析物特性(如化学形式)、测量基质、单位等；可通过检验医学溯源联合委员会网站或国家标准物质资源共享平台查询参考物质纯度、均一性、稳定性及互通性并制定相关评估程序[29]。建议8实验室应优先选择具有明确溯源信息的类固醇激素参考物质作为清(浆)基质中以制备一系列稀释校准品。类固醇激素LC-MS/MS测量程序性能测物浓度的标本或商品化室间质量评价(externalqualityassessment,EQA)3.室内质量控制：血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量程序室内质控的难时包含多个待测组分的商品化质控品。使用经处理的血清(浆)、冻干或合成基应。而未添加分析物的患者血清(浆)质控品可能在评估测量程序性能时比经过于制备质控品的类固醇标准品批号及基质应有别于制备校准品的类固醇标准品实验室应自行确定质控物靶值及最大允许不精密度(表4),将质控物放置量程序的质控方案和失控规则(如13s、32s等),以及失控后处理措施，如分建议10实验室应优先选择质量可靠、与患者标本基质一致的质控物，确4.分析批设置：血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量一般分批进行，分析质控品、患者样本、空白样品、校准确认品(用于验证校准曲线的有效性，非必量大于2×96个时，建议每检测批次(96个/批次)都包含校准品、质控品和空白样本。实验室应确定并文件化血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量程序的分析批长度[31]。建议11实验室应根据血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量系统的稳定性和成本效益确定分析批的长度，并通过校准曲线、质控和校准确认监测每个5.能力验证/室间质量评价：由于血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测程确度验证计划可同时监测测量程序的正确度和一致性，实验室应定期(1~2次/年)参加国家卫生健康委和/或省级临床检验中心正确度验证计划，如卫生健康处理的临床样本，通过参考方法对类固醇激素定值后，用于评估参评实验室LC的类固醇激素LC-MS/MS检测项目，实验室需定期(如2次/年)进行实验室间建议12实验室应定期(1~2次/年)参加国家卫生健康委和/或省级临床检验中心组织的类固醇激素检测能力验证计划，无能力验证计划的项目需定期(2次/年)进行实验室间比对。(五)数据收集及分析1.校准曲线接受原则：以校准品/内标物浓度比值为X轴、分析物/内标物/内标物响应比值代入校准曲线方程计算被测物浓度。分采用线性回归。如果校准曲线数据方差不同质(不同浓度点差异不同),推荐使用1/x或1/x2权重回归分析以使低浓度校准点的偏倚在可接受范围。实验室应血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量程序性能验证应明确校准曲线可接受标准：使用校准曲线计算出的校准品浓度与理论浓度之~115%(LOQ浓度点：80%~120%)。确定校准曲线斜率和截距的可接受标准，计算相关系数、确定其接受范围(通常需>0.99),并应用于常规分析的评估。校准曲线的可接受标准应与测量程序性能(如准确度)匹配。建议13血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS测量校准曲线计算的校准品浓度建议14应尽量通过优化积分参数完成每个待测类固醇激素的色谱峰自动建议15实验室应建立每个待测类固醇激素的色谱峰保留时间、背景杂质现明显降低提示前处理效率低或存在其他可导致离子抑制的干扰物或存在干扰内标定量离子对的杂质峰。对于内标峰面积比前后样品少2/3或50%的样品，应建议16实验室应日常监测每个待测类固醇激素的内标峰面积在标准品、量分析(定量离子对),另一个离子对用于定性分析(定性离子对)。定性离子物，应进一步分析原因。应同时评估分析物和内标物的/定性离子对比值差异的可接受范围(如±30%),并在每一个样品检测中予以监建议17实验室应日常监测每个待测类固醇激素的定量/定性离子对峰面三、血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检验后质量保证1.数据存储：实验室应保存血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS分析产生的完考CLSIEP28针对目标检测人群验证国外权威机构建立的参考范围[32],不同类固醇激素需按性别、年龄和/或月经周期分组，例如建议18实验室可针对目标检测人群验证国外权威机构建立的类固醇激素别和醛固酮增多症和皮质醇增多症(库欣综合征)密切相关；17a-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮及其雄激素代谢产物(如脱氢表雄酮、雄烯二酮)水平的异常往往检测可有效辅助诊断库欣综合征；对17a-羟孕酮、雄烯二酮、孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质酮和18-羟皮质酮的准确检测是确定CAH亚型的重要依据。此外，血清(浆)类固醇激素检测结果的解读应基于目标患建议19实验室应结合患者临床信息、方法性能、临床预期用途、类固醇代谢通路解读和报告血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测结果。血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测在精确评估类固醇激素水平、诊断类固醇激素失衡相关疾病(如CAH、肾上腺功能不全、高雄激素血症等)、监测治疗效果中发挥着越来越重要的作用。本共识对血清(浆)类固醇激素LC-MS/MSdmeasurement[2]RegeJ,TurcuAF,ElseT,etal.Snaldisease[J].JSteroidBiochemMolBiol,20diagnosis[J].JSteroidBiochemMolBiol,2010,121(3-5):481-490.DOI:10.1016/j.jsbmb.2010.02.017.ssspectrometry(LC-MS/MS)-basedasssinendocrinedisorders87.DOI:10.1515/cclm-2019-0869.[5]YuanTF,LeJ,WangST[J].JLipidRes,2020,61(4):580-586.DOI[6]秦嘉倩，陈方俊，彭颖斐，等.液相串联质谱法检测血浆醛固酮的方法学建立和性能评价[J].中华检验医学杂志，2017,40(4):247-252.DOI:10.37study:impactofcalibrationoncomparabilityofLC-MS/MSmeasurementofcirculatingcortisol,170H-progesteroneandaldosteroneinChemLabMed,2022,60(5):726-739.DOI:10.1515/cclm-2021-1028.ed.[S].Wayne,PA:CLSI,2015.[9]中国老年保健医学研究会检验医学分会，中国老年医学学会检验医学分会.液相色谱-串联质谱法检测25-羟维生素D标准化专家共识[J].中华检验医学杂志，2021,44(7):587-595.DOI:10.3760/114452-20201120[10]多囊卵巢综合征雄激素质谱检测共识专家组，中国人体健康科技促进会生育力保护与保存专业委员会.多囊卵巢综合征雄激素质谱检测专家共识[J].检验医学，2023,38(3):203-208.DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2023.03.[11]中华医学会检验医学分会，卫生计生委临床检验中心.液相色谱-质谱临床应用建议[J].中华检验医学杂志，2017,40(10):770-779.DOI:10.376907-913.DOI:10.1210/jc.2008-1902.[13]YoungWFJr.Pheochromocytomaandprimaryticapproaches[J].EndocrinolMetabClinNorthAm,1997,26(4):827.DOI:10.1016/s0889-8529(05)70283-8.[14]DenverN,KhanS,HomerN,etal.Currentstrategiesforquantifiol,2019,192:105373.DOI:10.1016/j.jsbmb.2opausalwomen:pastpresent,andfuture[J].Steroids,2010,75(4-5)[16]WangC,ShiraishiS,LeungA,etal.Val[17]CaoJ,SonilalM,RoperSM,etal.Evaluationofauidchromatography-tandemmassspectrorenalhyperplasiainpediatricpatients[J].ClinMassSp9:18-22.DOI:10.1016/j.clinms.2018.07.001.[18]HawleyJM,Adawayumtestosterone,androstenedione,17-hydroxyprogesterone,11β-hydrLabMed,2020,58(5):741-752.DOI:10.1515/cclm-2019-0959.[19]VesperHW,BotelhoJC.Standardizationof