荧光定量原理及其应用

荧光定量原理及其应用实时荧光定量PCR的基本原理

实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。第2页,共25页，2024年2月25日，星期天在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图.第3页,共25页，2024年2月25日，星期天荧光扩增曲线分为三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。第4页,共25页，2024年2月25日，星期天荧光背景信号阶段：为扩增最初的10～15个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。第5页,共25页，2024年2月25日，星期天指数期：此期PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。第6页,共25页，2024年2月25日，星期天荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。第7页,共25页，2024年2月25日，星期天CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，到达荧光阈值的CT值越小，反之越大。第8页,共25页，2024年2月25日，星期天利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第9页,共25页，2024年2月25日，星期天定量方法绝对定量：是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。第10页,共25页，2024年2月25日，星期天相对定量：是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算表达基因的差异，也称之为2-ΔΔCt。第11页,共25页，2024年2月25日，星期天其他定量方法第12页,共25页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR检测模式荧光定量PCR的理论基础：均基于荧光共振能量转移（FRET)的原理，即当一个荧光基团与一个淬灭基团的距离邻近时（＜10nm)，就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即消失。第13页,共25页，2024年2月25日，星期天检测模式SYBRGreenI检测模式：SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。第14页,共25页，2024年2月25日，星期天在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理第15页,共25页，2024年2月25日，星期天缺点：PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性。优点：通用性好，价格低，在科研中使用较普遍。第16页,共25页，2024年2月25日，星期天水解探针模式（Taqman）TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’

末端，而淬灭剂则在3’

末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’

端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’

外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。第17页,共25页，2024年2月25日，星期天一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信号的产生，随着循环数增加，荧光信号不断积累。第18页,共25页，2024年2月25日，星期天分子信标探针模式分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。第19页,共25页，2024年2月25日，星期天模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和淬灭基团紧紧靠近而被淬灭。当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。第20页,共25页，2024年2月25日，星期天其它还有双杂交探针、蝎形探针、LUXPrimers等模式。第21页,共25页，2024年2月25日，星期天引物设计原则引物最适长度为15～20bp.G+C含量为40～60%。引物的Tm值应相似，差异不超过1～2℃.产物长度在80～150bp.不能形成引物二聚体。第22页,共25页，2024年2月25日，星期天Taqman探针设计原则

长度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。尽量靠近上游引物。5’端不要有G，G会有淬灭作用，影响定量。3’端必须封闭。第23页,共25页，2024年2月25日，星期天实时荧光定量PCR的应用目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：1.DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。第24页,共25页，2024年2月25日，星期天2.基因表达差