免疫标记技术

免疫标记技术Immunolabelingtechnique2021/3/29星期一1

第一节免疫标记技术的基本概念一、免疫标记与标记免疫的概念二、常用的免疫标记物质2021/3/29星期一2

免疫标记与标记免疫免疫标记技术：标记物与免疫活性物质的联接技术标记免疫技术：以标记免疫物质检测相应靶物质的技术2021/3/29星期一3免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术酶荧光素同位素其它2021/3/29星期一4常用的免疫标记物质类别标记物用途荧光素FITC、RB200、TRITC免疫组化镧系元素螯合物免疫分析测定放射性核素

3H、14C、32P、57Gr免疫分析测定

125I、131I酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol、lucigenin免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定

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第二节标记免疫技术的分类一、按指示标记物质划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型2021/3/29星期一61、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、金免疫技术按指示标记物质划分的类型2021/3/29星期一71、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按测定方式划分的类型2021/3/29星期一8均相型（homogenous）非均相型（heterogeneous）2021/3/29星期一91、免疫测定技术2、免疫组化技术按测定用途划分的类型2021/3/29星期一10

第三节酶标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与鉴定2021/3/29星期一11常用标记方法1、常用酶辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）2、标记方法戊二醛交联法过碘酸盐氧化法2021/3/29星期一12戊二醛交联法(一步法）抗体-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶2021/3/29星期一13戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶2021/3/29星期一14过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环2021/3/29星期一15标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：去除游离酶方法：盐析、柱层析2、鉴定抗体活性酶活性标记物纯度2021/3/29星期一16

酶联免疫吸附实验enzymelinkedimmunosorbentassay

（ELISA）2021/3/29星期一17ELISA基本的实验过程2021/3/29星期一18ELISA技术的原理与方法间接法

夹心法

竞争法2021/3/29星期一19间接法2021/3/29星期一20夹心法2021/3/29星期一21竞争法2021/3/29星期一22

第四节荧光标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化2021/3/29星期一23常用标记方法1、荧光素的概念2、生物标记荧光素的要求3、常用荧光素标记原理与方法2021/3/29星期一24生物标记荧光素的要求1、具有与蛋白质共价结合的能力2、荧光效率高3、能与背景物质形成鲜明对比4、不影响蛋白质的生物、免疫活性5、标记方法安全、简便6、标记物稳定，易保存2021/3/29星期一25荧光抗体技术的原理与方法直接法间接法补体法双标记法

2021/3/29星期一26直接法间接法补体法双标记法2021/3/29星期一27标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：去除游离荧光素方法：柱层析2、鉴定抗体活性标记物结合度

F/P比值的应用意义2021/3/29星期一28

第五节放射性核素标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化2021/3/29星期一29直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T2021/3/29星期一30间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP2021/3/29星期一31结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法2021/3/29星期一32常用标记方法1、常用放射性核素2、125I的标记方法直接法（氯胺T法）间接法（连接法）2021/3/29星期一33标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：去除游离放射性核素方法：柱层析2、鉴定游离放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）应用意义2021/3/29星期一34第六节胶体金标记免疫技术(金标法)

胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)；

胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。

胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。2021/3/29星期一35胶体金免疫法与RIA、ELISA等方法相比,有许多优点：1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色剂，使操作更简便;2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有效期长;4.灵敏度高。2021/3/29星期一36免疫标记技术的比较FIAELISARIA敏感性较低高高特异性