(2012年)第十四章-维生素

第十四章维生素类药物的分析TheAnalysisofVitamines

第一节概述第二节维生素A的分析第三节维生素B1的分析第四节维生素C的分析第五节维生素D的分析第六节维生素E的分析第七节复方制剂中多种维生素的分析

一、概念维生素：是维持人体正常代谢功能所必需的一类生物活性物质。人体不能合成维生素，必须从食物中摄取。第一节概述如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。例如:VA

缺乏—夜盲症

VB1缺乏—脚气病二、分类

VitA、D2、D3、E、K1

等

脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)

VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。

公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来的维A。

1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。

1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。

1831年-胡萝卜素被发现。

1905年-甲状腺肿大被碘治愈。

1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。

1916年-维生素B被分离出来。

1917年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是缺乏维D引起的。

维生素发展史1920年-发现人体可将胡萝卜转化为维生素A。

1922年-维E被发现。

1928年-科学家发现维B至少有两种类型。

1933年-维E首次用于治疗。

1948年-大剂量维C用于治疗炎症。

1954年-自由基与人体老化的关系被揭开。

1969年-体内超级抗氧化酶被发现。

1970年-维C被用于治疗感冒。

1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果。第二节维生素A的分析-H维生素A醇；维生素A1；视黄醇-COCH3维生素A醋酸酯(Ch.P)-COC15H31维生素A棕榈酸酯R:

1.共轭多烯侧链的环己烯

一、结构与性质具有UV吸收维生素A的最大吸收波长在325~328nm，利用这一性质可以对维生素A进行鉴别或含量测定。具有多种立体异构体天然的维生素A侧链上的所有双键都为全反式的。维生素.ppt#133.幻灯片133VitA2VitA3易发生脱氢、脱水、聚合反应VitA1鲸醇(无活性)△或有金属离子存在时氧化↑2.共轭多烯侧链－－－性质非常活泼环氧化物VitA醛VitA酸3.溶解性

水中不溶，与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚能任意混合，乙醇中微溶。4.与三氯化锑呈色应用：鉴别、含量测定条件无水无醇CHCl3二、鉴别反应（一）三氯化锑反应蓝色紫红方法取维生素A油溶液1滴，加三氯甲烷10ml振摇使溶解；取出2滴，加三氯甲烷2ml与25％三氯化锑的三氯甲烷溶液0.5ml，即显蓝色，渐变为紫红色。（二）紫外分光光度法

无水乙醇－盐酸（100：1）

维生素A

326nm△350～390nm有3个吸收峰

脱水维生素A去水VitA（VitA3）↓VitAUSP

显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值BP

对照品法显色剂三氯化锑（三）薄层色谱法与对照品比较，确认本品是醇还是酯，是醋酸酯还是棕榈酸酯。三、含量测定

（一）紫外分光光度法

（二）三氯化锑比色法（三）HPLC立体异构体氧化降解产物合成中间体副产物（一）UV法维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸（一）紫外分光光度法---三点校正法

1.三点校正法的建立维A共轭多烯的结构：在325～328nm具有最大吸收。维A中的其他杂质与稀释用油：在紫外区也有吸收，对测定有影响。

2.测定原理（1）物质对光的吸收具有加和性，即

（2）维生素A中杂质的无关吸收在

310~340nm范围内可看作是直线，且随波长的增大吸收度下降。

3.波长的选择：（1）

1

VitA的max（328nm）（2）

2

3

分别在

1的两侧各选一点测定对象(Ch.P)VitA醋酸酯第一法等波长差法

=12nm第二法等吸光度法测定对象(Ch.P)

VitA醇

1=325nm,2=310nm,3=334nm4.测定方法

Ch.P收载2种方法第一法：直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯第二法：皂化法，适用于维生素A醇（1）第一法直接测定法

（适用于纯度高的维生素A醋酸酯）

方法：①核对

max

判断是否在326～329nm之间

max在326～329nm之间改用第二法（皂化法）

是否求算并与规定值比较

比值差值：

②计算吸收度比及比值差吸收度比：

药典规定值比值差值规定±0.02

③判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过

计算A328（校正）

用A328计算03%－15%－3%第二法第二法如果最大吸收波长在326~329nm之间;并分别计算5个波长下的差值，如有一个或几个超过±0.02，计算f值。分情况判断：④求

A＝·C·L⑤求效价（IU/g

）:每克供试品中所含维生素A的国际单位数（IU/g）。对于维生素A醋酸酯：

IU/g＝x1900

对于维生素A醇：

IU/g＝x1830换算因子换算因子

换算因子的计算：以维生素A醋酸酯为例（环己烷）：

1IU＝0.344

g维生素A醋酸酯

1g的维生素A醋酸酯就相当于多少国际单位

IU/g

换算因子＝

因此，维生素A醋酸酯换算因子：

⑥计算维生素A醋酸酯占标示量的百分含量

例：VitAD胶丸中VitA的含量测定

精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为A300：0.374A316：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344

求本品中维生素A占标示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637A328(校正)–A328(实测)A328(实测)×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87供试品中维生素A效价=

E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）标示量%=VA效价(IU/g)×每丸内容物平均装量(g/丸)标示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%注意p252页的练习题（2）第二法（皂化法，等吸收比法）（适用于维生素A醇）

第一法无法消除杂质干扰时用此法水溶性脂溶性

判断

max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算是否

判断A300/A325是否小于等于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算A325(校正)03%－3%基本步骤:

第一步A的选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已被基本消除第二步求注意：C为混合样品的浓度第三步求效价换算因数由纯品计算而得：第四步：求标示量％5.讨论(1)VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或称6/7定位法）推导而来。(2)在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。在测定前务必要校正波长。测定的样品应不得少于两份。

（3）VA遇光易氧化变质，操作应半暗室中快速进行，所用试剂不得含氧化性物质，以防VA被紫外线或氧化性物质破坏。练习题

维生素A醋酸酯胶丸的含量测定。操作如下：取内容物39.1mg，加环己烷溶解并稀释至100ml，在规定波长处测得的吸光度如下：

已知胶丸内容物平均重量为0.08736g，其每丸标示量为3000IU，计算占标示量的百分含量？中国药典规定的吸光度比值见下表。

解：由表可知328nm的吸收度最大。计算各波长的吸收度与328nm波长处的吸收度比值（Ai/A328），与药典规定值比较，其中比值A300/A328与规定比值之差为0.026，比值A360/A328与规定比值之差为0.0348，超过规定的(±0.02)限度，故需计算校正吸收度A328（校正）。A328（校正）=3.52(2A328-A316-A340)代入数值计算得：A328（校正）=3.52(2×0.671-0.607-0.55)=0.6512因为(A328（校正）-A328)/A328=2.95%<3.0%故应以A328计算含量其中A328=0.671，供试品稀释倍数D=100，胶丸的平均内容物重量=0.08736g=87.36mg，称取的内容物重量W=39.1mg，比色池厚度L=1mL，标示量为3000IU将数值代入计算公式得：标示量%=94.95%因此每丸胶丸内容物占标示量的百分含量为94.95%。（二）三氯化锑比色法

1.原理

2.方法：标准曲线法

3.讨论：（1）操作迅速，因产生的蓝色不稳定（2）反应介质需无水（3）温度影响较大(与标准曲线温差≤1℃)

（4）方法专属性（5）三氯化锑的腐蚀性λmax618nm～620nm（三）高效液相色谱法RP-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE的含量1、仪器与分析条件：HPLC-UV、C18(300×3.9mm）、甲醇－水（96：4）、流速：1.2ml/min、检测波长：0～8min(330nm),8min后(292nm）内标：维生素A醋酸酯血清样品的制备：LLE法制备分析方法的建立：线性、LOD、Recovery、Precision

一、结构与性质

（一）化学结构

维生素B1（盐酸硫胺）是由氨基嘧啶和噻唑环通过次甲基连接而成的季铵化合物。

第三节维生素B1的分析氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)（二）性质

1.溶解性

在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。

水溶液显酸性。

2.UV共轭双键λmax=246nm3.硫胺显碱性在硫胺的分子中具有两个碱性基团。噻唑环上的季铵嘧啶环上的氨基因此，硫胺可以和酸成盐。

4.硫色素反应维生素B1分子中的噻唑环在碱性条件下开环，再与嘧啶环上的氨基缩合，经铁氰化钾K3Fe(CN)6等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，溶于正丁醇中呈蓝色荧光。5.沉淀反应维生素B1分子中的含氮杂环，能够和生物碱沉淀试剂反应产生沉淀。6.氯化物的反应维生素B1是一种盐酸盐。呈氯化物的反应，用于鉴别。二、鉴别试验

（一）硫色素反应（VB1专属性反应，用于鉴别和含测Ch.P）

1.原理硫色素＋2H2.方法：见书p258VitB1H+H+H+（二）沉淀反应（三）氯化物的反应（四）硝酸铅的反应(S的反应)

维生素B1与NaOH共热，分解产生NaS，可与硝酸铅反应生成PbS的黑色沉淀。三、含量测定

非水滴定法紫外分光光度法硫色素荧光法（一）非水滴定法1.原理:VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团,在非水溶液中（在醋酸汞存在下），均可与高氯酸作用。喹哪啶红-亚甲蓝（紫红→天蓝）2.方法:

溶剂:冰醋酸、醋酸汞指示剂:喹哪啶红-亚甲蓝混合指示剂滴定液:高氯酸终点:天蓝色空白试验

3.讨论：（1）为何加入醋酸汞试液？（2）反应摩尔比为1：2。为什么？（3）方法为Ch.P收载的VB1原料药的含测方法。（二）紫外分光光度法

1.原理共轭双键结构，在紫外区有吸收。

2.方法

VB1片的测定（吸收系数法，Ch.P方法）

=421A=ECLg/100ml规格g/片VB1注射剂的测定（吸收系数法，Ch.P方法）规格g/ml体积稀释倍数3.讨论：维生素B1的紫外吸收峰随溶液的pH变化而变化。(三)硫色素荧光法

1.原理

2.方法【USP(24)】40ml具塞试管3支→对照品溶液5ml；其中2支加入氧化试剂3.0ml，再迅速加入异丁醇20ml，振摇。第三支试管中加入3.5mol/l的NaOH，同法操作为空白。另取三支试管加入供试品同法操作。各试管中加入无水乙醇2ml，分取异丁醇，进行荧光测定。

3.讨论：（1）硫色素反应为VB1的专属性反应，一定条件下形成的硫色素与VB1浓度成正比。（2）灵敏度高（3）不受氧化破坏产物干扰。（4）可用BrCN为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析。

一、结构与性质

（一）结构

1.有烯二醇结构，具有很强的还原性，能够被一些氧化剂氧化。

2.具有内酯结构,碱性条件下水解。

3.有2个手性碳，具有旋光性。

第四节维生素C的分析L－抗坏血酸（二）性质

1.溶解性

水中易溶，水溶液呈酸性；乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。

2.酸性

维生素C的分子中具有烯二醇的结构

C3上的羟基，由于受共轭效应的影响，

酸性较强，pKa=4.17

C2上的羟基，由于邻位羰基的影响，

酸性较弱，pKa=11.57

故维C一般表现为一元酸，能与NaHCO3作用生成钠盐。（一元酸）

3.还原性－－烯二醇基烯二醇基具有较强的还原性。烯二醇结构二酮基结构4.旋光性－－

2个手性碳原子，4个光学异构体，以L（＋）－抗坏血酸活性最强。手性C（C4、C5）有活性有活性无活性5.水解性－－内酯环强碱条件下，内酯环水解，生成酮酸盐。糖类的显色反应50℃结构与糖类相似6.糖类的性质－－7.紫外吸收二、鉴别试验

(一)与硝酸银反应（Ch.PBP）

VC的烯二醇具有还原性

(二)与2,6-二氯靛酚反应（Ch.P

）

2,6-二氯靛酚＋维C被还原成酚亚胺

还原型无色氧化型蓝色OHˉ玫瑰红色（玫瑰色）（无色）（三）与其他氧化剂反应亚甲蓝或高锰酸钾试剂褪色

碱性酒石酸铜砖红色沉淀

磷钼酸钼蓝

（四）糖类反应（USP）维C具有糖类性质50℃吡咯UV（五）（BP）0.01mol/LHCl三、杂质检查

（一）溶液的澄清度与颜色检查中国药典采用控制吸收度的方法

高于或低于pH5～6

VC水溶液内酯环水解

空气、光线、温度

脱羧糠醛聚合呈色

（二）铁、铜离子的检查原子吸收分光光度法

四、含量测定

碘量法

2,6-二氯靛酚滴定法

HPLC

(一)碘量法

1.原理

去氢抗坏血酸

取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6方法2.3.讨论（1）为何在酸性环境？反应在酸性溶液中进行，因为在酸性介质中，维生素C受空气中氧的氧化速度减慢。（2）加入新沸过的冷水的目的？是为了减少水中溶解的氧对测定的影响。（3）维生素C注射液测定时加入2ml丙酮？以消除注射液中抗氧剂亚硫酸氢钠对测定结果的干扰。（4)立即滴定?减少O2的干扰（二）2,6-二氯靛酚滴定法(USP、JP)1.原理

2,6-二氯靛酚＋维C被还原成酚亚胺酸性：玫瑰红无色碱性：蓝色

2.方法

酸性条件下，直接用2,6-二氯靛酚滴定，用滴定剂自身的颜色变化指示终点。终点颜色变化：无色玫瑰红色3.讨论：（1）并非维生素C的专一反应，其他还原性物质也有干扰。快速滴定2min内（2）可用2,6-二氯靛酚进行剩余比色测定.

（3）2,6-二氯靛酚滴定液不够稳定，需常标定，储备液不宜超过一周。

（4）专属性较碘量法为高。（定量过量）（测剩余染料）(三)高效液相色谱法人血浆中VitC浓度的HPLC法测定1、色谱条件2、标准溶液的制备3、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法学考察5、测定

一、结构与性质

维生素D是甾醇的衍生物（一）结构第五节维生素D的分析维生素D2－骨化醇维生素D3－胆骨化醇开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。

多烯：可进行紫外检测。

（二）性质

1.性状

2.溶解性

3.不稳定性：多个烯键

4.旋光性

5.显色反应：甾类化合物的共有反应

6.紫外吸收二、鉴别试验（一）显色反应醋酐-硫酸反应D2

黄红紫绿

D3

黄红紫、蓝绿绿三氯化锑反应橙红色渐变粉红三氯化铁反应橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应绿色（二）比旋度鉴别维生素D2维生素D3溶剂

浓度比旋度值无水乙醇无水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事项：应于容器开启30分钟内取样，在溶液配制后30分钟内测定。（三）其他鉴别方法

TLC、HPLC、制备衍生物测熔点（四）维生素D2、D3的区别反应

96％乙醇乙醇，85％硫酸

维D2红色（570nm）维生素D

维D3黄色（495nm）三、杂质检查

（一）麦角甾醇的检查

Ch.P维生素D2检查，维生素D3不检查

维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。

（二）前维生素D的光照产物四、含量测定方法

中国药典（2005年版）采用正相高效液相色谱法(NP-HPLC）测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯。根据样品的具体情况按以下三个方法进行分析。第一法：用于无维生素A醇及其它杂质干扰的情况，步骤如下：

1．系统适用性试验：测定重复性和分离度。

固定相：硅胶

流动相：正己烷-正戊醇（997：3）

2．测定校正因子：

3．含量测定：

2,6-二叔丁基对甲酚＋加热第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙醚、制备供试液A。

2．净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制备成供试液B。

固定相：ODS

流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量测定：取供试液B按第一法测定。

第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下：1．制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，正已烷溶解，得供试液C。

制备对照液：对照品储备液（异辛烷溶解）：稀释、加热。

2．含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样对照液和供试液，按外标法定量。讨论1、采用的是正相高效液相色谱法2、测定过程中应避免VitD的氧化3、皂化应剧烈振摇，水浴温度≤40℃，提取溶剂大多采用己烷或戊烷以消除苯的毒性4、若供试品中没有VitA醇及其它杂质干扰时，可以直接进样分析5、注意色谱系统适用性样品VitD、前VitD的制备方法一、结构与性质

（一）结构

第六节维生素E的分析苯并－二氢吡喃醇名称R1R2相对活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1苯环+二氢吡喃环+饱和烃链dl－α－生育酚醋酸酯（二）性质

1.溶解性维生素E为微黄色或黄色透明的粘稠液体，水中不溶，在无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中易溶。

2.水解性苯环上的乙酰化的酚羟基,在酸性或碱性溶液中加热可水解成游离生育酚，作为特殊杂质检查。

3.氧化性游离生育酚在有氧或氧化剂存在时，氧化成醌型化合物，碱性条件下，更易发生。4.紫外吸收特性二、鉴别试验

（一）硝酸反应（Ch.P、JP）

硝酸