PCR仪和凝胶成像系统

PCR仪和凝胶成像系统药学院：刘明华内容PCR的反应原理及反应体系PCR示例凝胶成像系统

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’3’模板Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段模板Mg2+dNTPthermusaquaticusTaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉（

Hot

spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…PCR反应条件72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸温度三点法温度、时间和循环次数。PCR仪（3）延伸

70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp（4）循环次数

主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR的基本原理PCR的基本原理小结

变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物PCR三步曲变性90～97℃延伸70～75℃PCR过程实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪用途广泛生命学科肿瘤遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR示例一、实验目的二、实验材料、仪器和试剂1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T质粒DNA2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR 反应缓冲液25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物21.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：

10XPCR反应缓冲液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL质粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水补充至25.0μL三、操作步骤25-35个循环2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为英国Techne多功能型PCR仪TC-4123.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。琼脂糖凝胶电泳PCR?逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)实时荧光定量PCR(quantitativePCR)多重PCR(multiplexPCR)免疫PCR差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR(insituPCR)逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

荧光定量PCR(FQ-PCR)

多重PCR(multiplexPCR)

原位PCR(InsituPCR)

原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。

基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测

优点：灵敏度高，可进行细胞内定位

锚定PCR(anchoredPCR)：

•引进锚定引物，可以克服序列未知或序列未全知的障碍。•在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，与此相对应的锚定引物poly(dC)一般应在十二聚以上。

不对称PCR(asymmetricPCR)

不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序。

差别PCR(differentialPCR)

差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中，用同一套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。ChampChemiBasic系列全自动化学发光/荧光/可见光成像分析系统可对各种化学发光、荧光、可见光图像进行拍摄和分析:■核酸检测各种荧光染料，如EB,SYBRGreen■蛋白检测考马斯亮蓝胶，银染胶以及荧光染料如SyproRed,SyproOrange,Pro-QDiamond,DeepPurple™标记胶/膜/芯片等；■化学发光检测WesternLightning,ECL,ECLplus,SuperSignal等发光底物；■其他应用各种杂交膜，蛋白转印膜，培养皿菌落计数，酶标板，点杂交，蛋白芯片，TLC板应用范围

EB染色应用于双MarkerDNA琼脂糖凝胶电泳成像SYBRGreen荧光染料应用于DNA琼脂糖凝胶电泳的成像

考马斯亮蓝染色玉米种子蛋白质SDS电泳的凝胶成像微孔板荧光成像ECL发光底物检测小鼠BSA蛋白的蛋白免疫印迹（WesternBlot）的成像SuperSignal发光底物检测WestPico底物克隆计数

抑菌圈成像和分析昆虫的成像和测量分析功能可自动识别各种电泳图像条带，自动生成峰值曲线图，自动计算分子量、条带含量、百分比、IOD值、等电点等