医学基础免疫学实验指导

医学基础免疫学实验指导

主编金伯泉李恩善

Q免疫血清的制备

❶淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

。免疫球蛋白纯化技术

盐析法纯化免疫球蛋白

DEAE—SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白

SPA-SepharoseCL-4B亲和层析纯化IgG及IgG亚类

高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

单克隆抗体亲和层析柱纯化重组人a2a干扰干(rHuIFN-a2a)

。免疫球蛋白标记技术

酶标记抗体

荧光素标记抗体技术

力标记单克隆抗体技术

。标记抗体的应用

ELISA

BA-ELISA

免疫斑点试验

化学发光免疫分析

力标记单克隆抗体竞争结合试验

Q细胞分离纯化技术

Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

。溶血空斑形成试验

9细胞表面标记的检测技术

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)免疫组化染色技术检测淋巴细胞麦面标

记

活细胞免疫荧光技术——流式细胞仪标本的制备

•淋巴细胞增殖功能的测定

0人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验

Q杀伤细胞功能的检测

自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的杀伤功能

混合淋巴细胞培养

9细胞因子生物学活性的检测

白细胞介素T生物学活性检测

ConA刺激小鼠胸腺细胞检测ILT生物学活性

应用EL-4、CTLL检测ILT生物学活性

白细胞介素-2生物学活性检测

白细胞介素-6生物学活性检测

干扰素生物学活性检测

肿瘤坏死因子-a生物学活性检测

❷细胞因子及其受体的免疫学方法检测

夹心法ELISA检测人可溶性白细胞介素2受体(SIL-2R)

夹心法ELISA检测人白细胞介素8(IL-8)

夹心法ELISA检测人a2a、a2b干扰素(IFN-a2a、a2b)

免疫血清的制备

撰稿李恩善

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血

清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治

疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如

以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用

免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清

的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，

必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也

是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

原理

免疫方法

放血

分离血清

结果鉴定

材料

注意事项

一、原理

具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特

异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，

因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定

簇的抗体混合物（即多克隆抗体）。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，抗

□现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆

性B细胞参与再次应答所致。

二、免疫方法

根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说

明。

1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）

下称FCA-IgG）液1ml,每侧脚掌皮下各注入0.5mlo

3.第二次免疫：间隔10T4天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注

入FCA-IgG,每个淋巴结注0.1ml,其余注入淋巴结附近皮下共1口1。如淋巴结

未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔7T0天后，从耳静脉采血0.5〜1.0ml,分离血清，以双相琼脂扩

散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。效价至少应达到1：16以上时才能放

血。

5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（人IgG）耳静脉内注射免

疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价

达到要求应立即放血。另外，也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂（FIA）乳化

的抗原（人IgG）（简称FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2

次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

三、放血

（-）心脏采用血法

1.家兔仰面，四肢缚于动物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；

2.剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；

3.用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并

使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；

4.用50ml注射器（连接16号针头），倾针45°角度，对准心搏最强处刺

入心脏抽血致死；

5.将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

（-）颈动脉放血法

1.家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；

2.沿颈部中线切开皮肤约10cm,分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的

胸锁乳突肌；

3.分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之

游离；

4.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。

近心端的动脉用血管夹夹住；

5.用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再

将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；

6.松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。-一般一只家兔可放血80〜

100mlo

四、分离血清

将三角烧瓶的血置37c温箱1小时，再置4c冰箱内3〜4小时。待血液凝

固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防

腐剂(0.01%硫柳汞或0.02%叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。

五、结果鉴定

以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定

免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关

部分。

六、材料

(-)动物：健康成年家兔，雄性，体重2〜3公斤。

(二)器材：剪刀、镜子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶

(10ml),量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、

黑丝线、塑料放血管等。

(三)试剂

1.灭菌生理盐水；

2.纯化人IgG(10mg/ml)；

3.消毒酒精及碘酒；

4.羊毛脂；

5.石蜡油；

6.活卡价苗(BCG)(75mg/ml);

7.弗氏不完全佐剂(FIA)制备:称羊毛脂10克,逐滴加入优质石蜡油40mL

边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml),高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。

8.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，

吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg/ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg

/ml)抗一滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合

格。

七、注意事项

1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用

两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。

2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响

抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡

混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合

器上使之剧烈振荡（频率2900转/分，振幅6mm）；后者是将免疫用的佐剂和抗

原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这

两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。

3.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若

抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物（0.005mgN）产生抗体，以致导致免疫血

清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家

兔，当再次注射完全佐剂时，可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次

免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应

的发生。

4.抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，

免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的

情况下，一次注入的总剂量以0.5mg/kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大

10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。

5.免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6

点皮下注射，同时于两侧肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml,间隔

2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

撰写刘雪松

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了

单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了

新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

细胞融合前准备

细胞融合，选择杂交瘤

抗体的检测

杂交瘤的克隆化和冻存

单克隆抗体的大量生产

单克隆抗体的鉴定

影响因素、失败原因分析

—＞细胞融合前准备

（-）免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗

原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细

胞性抗原为例的免疫方案：

初次免疫1X107/0.5mlip（腹腔内注

射）

I2〜3周后

第二次免疫1X107/0.5mlip

I3周后

加强免疫（融合前三天）1X107/0.5mlip或iv（静脉

内注射）

取脾融合

2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福

氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放

一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全

佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫Agl-50ug加福氏完全佐剂皮下多点注射

I（一般0.8〜1ml0.2ml/点）

I3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

（ip剂量不宜超过0.5ml）

I3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

I（5〜7天后采血测其效价，检测免疫效果）

I2〜3周后

加强免疫，剂量50〜50011g为宜，ip或iv

I3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如

①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降

低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使

用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

（二）饲养细胞

在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛

选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:

小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成

纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液

氮罐长期保存，随用随复苏。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6〜10周龄

I

拉颈处死浸泡于75%酒精，消毒3〜5分钟

I

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

I

用无菌注射器注入6〜8ml培养液

反复冲洗，吸出冲洗液

放入10ml离心管，1200转/分离心5〜6分钟

用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数

1X105/ml

加入96孔板，100u1/孔

放入37CCO/孵箱培养

一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5〜8X106腹腔巨噬细胞,

若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5X10"/ml,小鼠脾细胞为

1X9/ml,小鼠的成纤维细胞(3T3)IX及/ml,均为100ul/孔。

(三)骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种

杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAbo

常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMH640,DMEM培养基。小牛

血清的浓度一般在10〜20%,细胞的最大密度不得超106/ml,一般扩大培养

以1：10稀释传代，每3~5天传代一次。细胞的倍增时间为16〜20小时，上述

三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细

胞。

-一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT

的敏感性，每3〜6月应用8〜AG(8氮杂鸟噂吟)筛选一次，以防止细胞的突变。

保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%,也

是决定细胞融合的关键。

(四)免疫脾细胞

免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞素浆母细胞。一般取最

后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例

较大，融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置

平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体

积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2X108左右。

二、细胞融合，选择杂交瘤

(-)细胞融合流程

(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0,lOOOrpm离心5分钟，弃上清，用

不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml

塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

(6)在室温下融合：

①30秒内加入预热的lml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMS0,边加

边搅拌。

②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml,2ml,

3mL4ml,5ml和10ml。

(7)离心，800rpm,6分钟。

(8)弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMH640轻轻混悬，切记不能

用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100口1/孔，37℃、

5%CO?孵箱培养。

一般一块96孔板含有1XIO,脾细胞。

(二)HAT选择杂交瘤

应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题

中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50X

贮存，用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。

因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200P1/孔。所以在加选

择培养液时应加3倍量的HAT0我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3

进行选择，可得到满意的筛选结果。

50XHAT

H:5X103M

A:2X105M

T:8X10'M

一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两

周，改用一般培养液。

三、抗体的检测

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免

疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特

异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法,

一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：

1.ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。

2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

3.FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

四、杂交瘤的克隆化和冻存

克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。聚r为经过HAT筛选后的杂交瘤

克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的

克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）

分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。

克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分

泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体

分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化

过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，

从而丧失产生抗体的能力。

（-）克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

1.有限稀释法的程序

①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）

②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1〜5X103/ml

③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml,

100“/孔加AB、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml

含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml,100u1/孔加D、E、F三排，为

每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞

数5个/ml,1001H/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

④培养4〜5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养

液200口1/孔。

⑤第8〜9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HTo

2.软琼脂法

①软琼脂的配制

含20%FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640

1%琼脂水溶液：高压灭菌，42°C预热。

0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640

配制而成。置42℃保温。

②用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，

在室温中待凝固后作为基底层备用。

③按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

(4)1ml0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液

相混合。

⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育

于37℃,5%C0z孵箱中。

⑥4〜5天后即可见针尖大小白色克隆，7〜10天后，直接移种至含饲养细

胞的24孔板中进行培养。

⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

(-)杂交瘤细胞的冻存

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要

的。因为在没有建立一•个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时

可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则

因为上述的意外而全功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支

安瓶含1X10,以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在

24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安孤。

细胞冻存液：

50%小牛血清

40%不完全培养液

10%DMSO(二甲亚碉)

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再

降温时一般按每分钟降温2〜3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至

后放-70C超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻

存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存

数年或更长时间。

五、单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。

但此方法产量低，一般培养液含量为10-60ug/mL如果大量生产，费用较高。

2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1〜3X10,/ml接种于小鼠背部

皮下，每处注射0.2ml,共2〜4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10〜20天）

则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到ITOmg/ml。但采血量有限。

②腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液体石腊

于BaLb/c鼠，1〜2周后腹腔注射1X10,个杂交瘤细胞，接种细胞7〜10天后

可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频

于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1〜10ml

腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达

5-20mg/ml,这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种

小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

六、单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定：

1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其

抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备

抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细

胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗

体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋

白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进

行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的

兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要

用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验

时，如加入适量的PEG（3%）,将有利于沉淀线的形成。

3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物

学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于

易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测

定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应

抗原结合的亲和力。

七、影响因素、失败原因分析

由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意

就会造成失败。

其主要失败原因和影响因素有:

1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问

题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原

体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能

造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细

胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细

胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹

腔，待长出腹水或实体瘤时，辇.菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污

染。

2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列

因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的

筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含

量不足。

3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

①融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞

发生突变，变成A抵抗细胞所致。

②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非

抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染

色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌

的有效措施。

三要：

要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

要定期进行再克隆。

三不要：

不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌

抗体的杂交瘤细胞。

不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好儿代。

4.杂交瘤细胞难以克隆化

可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污

染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

免疫球蛋白纯化技术

撰稿金伯泉朱勇欧阳笑梅

在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞培养上清以及腹水中的抗体需经纯化

后再用于各种免疫学检测中去o免疫球蛋白常用的纯化方法有盐析法、凝胶过滤、

离子交换层析、亲和层析以及高效液相色谱等方法。这些方法各有优缺点，应根

据抗体的特点、纯度要求和实验室具体条件加以选择。

盐析法纯化免疫球蛋白

DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白

SPA-SepharoseCL-4B亲和层析纯化IgG及IgG亚类

高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

单克隆抗体亲和层析柱纯化重组人a2a干扰素(r素IFN-a2a)

盐析法纯化免疫球蛋白

撰稿欧阳笑梅

原理

主要材料

盐析的操作步骤

影响盐析的因素

(-)原理

蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程

度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性

盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消

失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷

大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

(-)主要材料

1.试剂：

(1)正常人混合血清；灭菌生理盐水。

(2)饱和硫酸镀溶液的配制：

称(NHjSOKARMOO〜425克，以50〜80℃之蒸储水500ml溶解，搅拌20分

钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水(15NNHQH)调PH至7.4。配制好的饱和硫酸钱，

瓶底应有结晶析出。

(3)蔡氏试剂配制：

称Hgl11.5克，KI8克，加蒸储水至50ml,搅拌溶解后，再加入20%Na0H

50mlo

(4)0.02M,PH7.4磷酸盐缓冲盐液(PhosphateBufferedSalinePBS)配

制：

贮存液：

A液:0.2MNa2HP04：Na2HP04•12H2071.64克,加蒸储水至1000ml；

B液:0.2MNaH2P*NaH2P4•2H203.12克,加蒸储水至1000ml；

应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。

(5)0.IM,PH7.4磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferPB)配制:

将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸储水对倍稀释即成。

(6)20%磺基水杨酸。

2.器材：

普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751括型紫外分光光度计、扭力天平，粗

天平。

透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5〜9.0)、眼科镜子、小剪刀。

烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。

(三)盐析的操作步骤

取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与

稀释血清等量的饱和硫酸钱［终浓度为50%饱和(NH^SOJ

I4℃,3小时以上，使其充分沉淀

离心(3000rpm),20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。

再逐滴加饱和硫酸钱X/2ml

I置4℃,3小时以上［此时(NHJSO”的饱和度为33%)］

重复上述第二步过程1?次。将末次离心后所得沉淀物以0.02M

PH7.4PBS溶解至Xml装入透析袋。

|对PBS充分透析、除盐换液3次，

I至蔡氏试剂测透析外液为无黄色

将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以75LG紫外分光光计测蛋白

含量。

方法如下：

蛋白含量(mg/ml)=(1.45XOD280nm-0.74X0D260nm)X样品稀释

度。

注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。

m影响盐析的因素

1.蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可

影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的

饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故

常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。

2.离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸镂饱和

度不同，析出的成分就不同，饱和度为50%时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白

析出；饱和度为33%时丫球蛋白析出。

3.盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。

4.PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH

改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。

5.温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于

25℃时较更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。

6.蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分

离。

DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白

撰稿欧阳笑梅

原理

试剂和器材

操作步骤

注意事项

(-)原理

DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换

剂。用NaOH将CL型转变为0H型后，可吸附酸性蛋白。血清中的Y球蛋白属于

中性蛋白(等电点为PH6.85〜7.5),其余均属酸性蛋白。在PH7.2〜7.4的环境

中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有Y球蛋白不被吸附。因此，

通过柱层析Y球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便

可分离获得纯化的IgGoDEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。

(二)试剂和器材

1、试剂：

(1)盐析提取的人Y球蛋白；

(2)0.5NNaOH,0.5NHC12MNaCl,10%NaN3；

(3)DEAE-SephadexA-50,聚乙二醇(PEG)；

(4)0.IM,PH7.4PB(配制见盐析部分);

2、器材：

(1)层析玻璃柱(L3X40cm),滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；

(2)普通冰箱，751梧型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、

干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；

(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；

(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。

(三)操作步骤

1、DEAE-SephadexA-50预处理

称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸储水，1小时后倾去

上层细粒。按每克A-50加0.5NNaOH15ml的比例，将A-50浸泡于0.5NNaOH

中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸储

水抽洗至PH呈中性；再以0.5NHC1同上操作过程处理，最后以0.5NNaOH再处

理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.IM,PH7.4PB中过夜。

2、装柱

(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶

或塑料管并关闭开关。

(2)将0.IM,PH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以

同上缓冲液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋

夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞

塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连

接。

3、平衡:启开出水口螺旋夹，控制流速12T4滴/分钟，使约2倍床体积的

洗脱液流出。并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是

否相同。达到一致时关闭出水口，停止平衡。

4、加样及洗脱：

启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相

切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应〈床体积的2%,蛋

白浓度以QOOmg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面

相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进

入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成

一密闭系统。并控制流速12〜14滴/分钟。

5.收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3〜5ml。共收集

10〜15管。

6.测蛋白：以751-G型紫外分光光度计分别测定每管0D280nm，与OD260nm,

按前述公式计算各管蛋白含量。并以0D280nm为纵座标，以试管编号为横座标，

绘制洗脱曲线。

7.合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以

PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐剂，于4℃保存备用。

8.A-50凝胶的再生:在柱上先以2MNaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的

OD280nm<0.02,再以蒸储水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍

即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4c保存；近期不用时，以无水酒精洗2

次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

(四)注意事项

1.柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就得获得理想的分辨率，但由

于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱

的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

2.纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。样品与A-50凝胶必

须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

3.所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

4.洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。

5.上样的体积要小，浓度不宜过高。

6.加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

SepharoseCL-4B亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类

撰稿金伯泉欧阳笑梅

原理

操作步骤

试剂器材

注意事项

(~)原理

葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力,并与

不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于

SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹

水中的IgG抗体。

(-)操作步骤

用0.IMPH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶,15min。按1g

干胶200ml

上述缓冲液充分洗涤凝胶（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）

装柱后用0.IMPH8.0磷酸缓冲液平衡

标本可用硫酸镂粗提物，先10,000g离心除去杂质，必要时用0.22um滤膜

过滤。

上样前用IMPH9.0Tris液调整标本液PH至&1或对平衡液透析过夜

加样，一般按25~30mgIgG/g湿胶比例加样,室温作用15min,0.IMPH8.0

磷酸缓冲

液充分淋洗至淋洗液0D值为＜0.02。

用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgGl一般用

PH6.0；纯化

IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.IMPH3.0醋酸盐缓冲液或0.IMPH3.0

Glycine-HCl

缓冲液洗脱。

用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱

液

收集洗脱液测0D值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定

（三）试剂器材

1.SPA-SepharoseCL-4B（pharmacia）

2.磷酸缓冲液0.IMPH8.0+0.02%NaN3

3.枸椽酸缓冲液0.IMPH6.0-I

0.IMPH4.0|-+0.02%NaN3

0.IMPH3.0」

4.IMPH9.0Tris溶液

5.再生缓冲液（1）0.IMTris含0.5MNaCl调正PH至&5+0.02%NaN：,；

（2）0.IM

醋酸钠含0.5MNaCl调正PH至4.5+0.02%NaN3o

6.1〜10ml柱体积的玻璃柱或塑料柱

m注意事项

1.SPA-SepharoseCL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10〜20次左

右。方法:先用10倍柱体积0.IMPH8.5Tris含0.5MNaCl溶液洗脱柱上的残存

杂蛋白；再用10倍柱体积0.IMPH4.5醋酸钠缓冲液含0.5MNaCl液洗脱柱上残

存的杂蛋白；0.1MPH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

2.SPA-SepharoseCL-4B亲和层析法还可用于：（1）除去抗体液中IgG,检

测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；（2）除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG

后的Fc段；（3）回收或纯化免疫复合物。

3.、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA

结合的能力。

高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

撰稿金伯泉

从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层

析等。应用TSKDEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速

度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。

原理

操作步骤

试剂和器材

注意事项

（-）原理

根据离子交换原理，将经硫酸钱粗提的含McAbY球蛋白上样结合于层析柱

上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

（二）操作步骤

腹水10,0008离心10111行，除去细胞和杂质，在4c条件下逐滴加入饱和硫

酸镀溶液，

使终浓度为40%饱和硫酸铁

I搅拌20~30min

离心,沉淀用40%饱和硫酸锭洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A（PH8.520mM

Tris缓

冲液）透析除盐

!4c过夜

用带有1000ul样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A

液平衡的

TSKDEAESPW离子交换层析柱

洗脱流速lml/min

0~lmin：Of5%缓冲液B（20mMTris,PH8.5,含2.OM醋酸钠）

1〜20min（线性梯度洗脱）：5-20%缓冲液B

20〜22min：20-0%缓冲液B

洗脱液用紫外280nm进行监测

收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

（三）试剂和器材

1.TSKDEAESPW离子交换层析柱（75X7.5mm,BioRad）

2.高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外

280nm监测系统）。

3.PBS,缓冲液A和B

（四）注意事项

1.所用缓冲液和加样粗提物均需0.22nm滤膜过滤。

2.在本实验条件下，IgGl峰一般在线性梯度洗脱开始11〜12min。但不同

类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retentiontime)有所差异。

单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化

重组人a2a干扰素(rHuIFN-a2a)

撰稿朱勇

重组人a干扰素作为一种具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长及免疫调节

作用的细胞因子新型药物，已在国内外广泛投入临床应用，并取得了显著的疗效。

国际上对用于临床的重组干扰素的纯度要求很高，美国NIH规定必须在90%以

上，因此生产者普遍采用亲和层析纯化法。我们研制了rHuIFN-a2a的McAb3F1,

与CNBr活化的Sepharose4B交联制成亲和层析柱,经1年60余次较大规模试用

表明具有较理想的亲和层析纯化rHuIFN-a2a的性能，达到了国内外同类McAb

的水平。由于McAb3F1也能和rHuIFN-a2b结合,故极有可能亦适用于

rHuIFN-a2b的亲和层析纯化。

性能指标

操作方法

保存方法

•、性能指标

1.McAb的特性：IgGl,间接ELISA效价10，对rHuIFN-a2a具中和活性。

2.洗脱的rHuIFN-a2a纯度：＞90%。

3.洗脱的rHuIFN-a2a比活性：21X10TU/mg。

4.rHuIFN-a2a的回收率：295%。

5.亲和柱的稳定性：4℃操作和保存情况下，使用60余次1年时间性能无

明显下降。

6.与国外McAb比较：各项指标绝不亚于英国Celltech公司生产的McAb

NK2o

二、操作方法

1.rHuIFN-a2a的粗提：表达rHuIFN-a2a的工程菌用盐酸呱裂解，过DEAE

凝胶柱粗提，收集活性峰。

2.亲和层析：rHuIFN-a2a粗提物用pH7.2,0.15mol/LPBS透析过夜，上

样于经PH7.2,0.15mol/LPBS平衡的亲和层析柱，流速0.5ml/分，然后用大量

PBS流洗至流出液0D280W0.02,再用pH2.4,0.Imol/L甘氨酸-HC1洗脱,洗脱液

立即转至PH7.2,0.15mol/LPBS中透析过夜，测定蛋白浓度、纯度和活性。

三、保存方法

1.亲和柱的再生：先后用10个柱床体积、含0.5mol/LNaCl的

pH8.5,0.Imol/LTris-HCl和pH4.5,0.Imol/L醋酸钠缓冲液流洗亲和柱，再用

pH7.2,0.15mol/LPBS充分平衡。

2.贮存：加入1/万的叠氮钠防腐，贮存于4℃冰箱。

免疫球蛋白标记技术

撰稿董邦全金伯泉赵宁

酶标记抗体

荧光素标记抗体技术

'力标记单克隆抗体技术

酶标记抗体

撰稿董邦全

酶制剂及其底物

HRP标记抗体的方法

工作浓度的选择

注意事项

酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好

坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常

用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的

质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方

法。目前.，高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称HRP）国内已有商品供应。高质

量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合

物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

（-）酶制剂及其底物

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记

抗体用的酶应满足下列要求：（1）来源方便，易于纯化；（2）比活性高，性质稳定；

（3）酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化

物酶（HRP）和磴性磷酸酶（AP）,其次还有葡萄糖氧化酶，8-半乳糖甘酶、溶菌酶

和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）比活性高，稳定，分

子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，

它是由无色的酶蛋白和棕色的铁吓琳结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多

个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3-9,酶催