测序技术介绍

测序技术介绍生物学中心法则2TCAGCG碱基人类基因组-30亿个碱基对核苷酸生命密码：A

T

CG3NGS：

“高通量测序”。以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。由于这项技术使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep

sequencing)。测序发展历程第二代测序第一代测序传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的测序技术统称为第一代测序。它在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划。主要包括罗氏454公司的454测序技术

、Illumina公司的Solexa测序技术和LifeTechnologies公司的IonTorrent测序技术

。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如生物科学公司的单分子测序仪，以及正在研制的太平洋生物科学公司的单分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术等2005年开始20世纪80年代中期第三代测序正在研发什么是测序？什么是NGS?Sanger测序又叫双脱氧链终止法，就是把脱氧核苷酸的3-OH，变成双脱氧核苷酸，它能终止DNA链的延伸。一代测序(Sanger测序)41、将4种ddNTP分别混合到dNTP中；2、DNA合成；3、通过高分辨的凝胶电泳分离大小不同的片段。4、图谱中即可直接读得DNA碱基序列测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%一代测序(Sanger测序)5ABI3500ABI3130ABI3730优势：1.最早，金标准2.读长:~1000bp3.高质量劣势：1、通量低，2、成本高3、耗时一代测序仪一代测序(Sanger测序)6二代测序流程(边合成边测序)文库制备上机测序数据分析1、DNA提取2、DNA片段化3、加接头4、PCR扩增5、捕获目标序列(全基因组无)6、变性解链7、上机测序前质控1、将文库固定在流动平板上（flowcell）2、桥式扩增3、边合成边测序1、序列拼接2、与已知参考基因组比对7二代测序的基本概念测序深度（SequencingDepth）：测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小（Genome）的比值，它是评价测序量的指标之一。测序覆盖度（coverage）：测序分析后组装得到的基因组序列通常无法完全覆盖所有区域，覆盖度就是最终得到的结果占整个基因组的比例Qn值是指的测序过程碱基识别（BaseCalling）过程中，对所识别的碱基给出的错误概率。

Q20，则错误识别的概率是1%，即错误率1%，或者正确率是99%；

Q30，则错误识别的概率是0.1%，即错误率0.1%，或者正确率是99.9%；

Q40，则错误识别的概率是0.01%，即错误率0.01%，或者正确率是99.99%；8人类基因组测序(基因组大小3Gb)

Sanger测序法IlluminaHiSeq2000高通量测序耗时13年，全世界科学家合作，花费约30亿美元约需2周，一个实验室操作，费用约为1万多美元优点：1、通量高，能同时测许多序列；2、测相同数据量，时间短；3、经济成本低；缺点：1、二代结果准确性99.9%,需要一代验证；2、读长短，拼接麻烦；MiseqNextseq500第二代测序的特点9一代测序二代测序通量低高准确度精准（99.999%）准确（99%）耗时长短读长长~1000bp50~400bp成本高低

现在应用于医学上的基因检测技术通常是一代和二代结合使用，取长补短，发挥互补优势；用二代测序进行检测，用一代测序进行验证。一代测序和二代测序的比较10第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。优势：读长较长，~10kb可避免扩增带来的误差扩增拓展了测序技术的应用领域：RNA测序、ctDNA测序缺陷：1）总体错误率偏高

2）成本较二代测序高；

3）生物分析软件也不够丰富三代测序11LifeProton测序平台12Roche454测序平台IlluminaSolexa测序平台BGIcPAS测序平台ABISolid测序平台博奥Bes4000测序平台NGS主要厂家介绍DNA

(0.1-1.0ug)

LibrarypreparationClustergeneration5’5’3’GTCAGTCAGTCACAGTCATCACCTAGCGTAGT123789456ImageacquisitionSequencingBasecallingTGCTACGAT…LightBlockFluorescenceIllumina

Solexa测序平台13组合探针锚定链接测序法（cPAS）华大基因BGISEQ500测序平台14Silicon

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