大肠杆菌基因工程

大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程第1页基因工程5

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基因工程基础概念基因工程基础原理基因工程所需基础条件基因工程操作过程目标基因克隆与基因文库构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程大肠杆菌基因工程第2页D基因工程菌遗传不稳定性及其对策6大肠杆菌基因工程C大肠杆菌基因工程菌构建策略B外源基因在大肠杆菌中高效表示原理A大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素大肠杆菌基因工程第3页A大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征6大肠杆菌基因工程大肠杆菌表示外源基因优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表示系统成熟完善繁殖快速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA同意为安全基因工程受体生物大肠杆菌基因工程第4页A大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征6大肠杆菌基因工程大肠杆菌表示外源基因劣势缺乏对真核生物蛋白质复性功效缺乏对真核生物蛋白质修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确异源蛋白细胞周质内含有种类繁多内毒素大肠杆菌基因工程第5页B外源基因在大肠杆菌中高效表示原理6大肠杆菌基因工程开启子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数大肠杆菌基因工程第6页开启子开启子最正确距离探测目标基因EEAEE开启子A酶切开Bal31酶解目标基因大肠杆菌基因工程第7页开启子开启子筛选AprorigalKpKO1终止密码子采取鸟枪法战略，将适当大小DNA片段克隆到开启子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上galE、galT与质粒上汇报基因galk表示产物联合作用，可将培养基中半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-大肠杆菌受体菌株含有外源开启子活性重组克隆大肠杆菌基因工程第8页开启子开启子构建-35区序列-10区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac开启子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac

=

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Ptrp

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Plac大肠杆菌基因工程第9页开启子开启子可控性P乳糖开启子Plac可控性：OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表示；诱导物能够使开启子Plac介导转录大幅提升大肠杆菌基因工程第10页开启子开启子可控性Plac乳糖开启子Plac可控性：OPlacO高效转录葡萄糖代谢野生型Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP基底水平转录结合开启子控制区，进而促进Plac介导转录。葡萄糖代谢使cAMP降低，也能阻遏Plac介导转录。所以，基因工程中使用乳糖开启子均为抗葡萄糖代谢阻遏突变型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP浓度降低PlacUV5O高效转录大肠杆菌基因工程第11页开启子开启子可控性Ptrp色氨酸开启子Ptrp可控性：Otrp除去色氨酸色氨酸开启子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常细菌培养体系中，除去色氨酸是困难，所以基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导目基因表示色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效转录阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效转录OtrpPtrp大肠杆菌基因工程第12页开启子开启子可控性l噬菌体开启子PlL可控性：噬菌体开启子PL受CI阻遏蛋白阻遏，极难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型cI突变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目标基因表示。但在大型细菌培养罐中快速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目标基因表示PtrpABcI857PL目标基因阻遏作用PtrpABPL表示色氨酸大肠杆菌基因工程第13页终止子强化转录终止必要性外源基因在强开启子控制下表示，轻易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近DNA序列，形成长短不一mRNA混合物过长转录物产生在很大程度上会影响外源基因表示，其原因以下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需时间就对应增加，外源基因本身转录效率下降；假如外源基因下游紧接有载体上其它主要基因或DNA功效区域，如选择性标识基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处转录可能干扰质粒复制及其它生物功效，甚至造成重组质粒不稳定性；过长mRNA往往会产生大量无用蛋白质，增加工程菌无谓能量消耗；更为严重是，过长转录物往往不能形成理想二级结构，从而大大降低外源基因编码产物翻译效率大肠杆菌基因工程第14页终止子强终止子选择与使用

当前外源基因表示质粒中常见终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上Tf。对于一些终止作用较弱终止子，通常能够采取二聚体终止子串联特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也能够象开启子那样，经过特殊探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选pCP1AproriTcr筛选Apr、Tcs转化子大肠杆菌基因工程第15页核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中高效表示不但取决于转录开启频率，而且在很大程度上还与mRNA翻译起始效率亲密相关。大肠杆菌细胞中结构不一样mRNA分子含有不一样翻译效率，它们之间差异有时可高达数百倍。mRNA翻译起始效率主要由其5‘端结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）大肠杆菌基因工程第16页核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包含以下四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它经过识别大肠杆菌核糖体小亚基中16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而开启翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大个别基因以AUG作为阅读框架起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；SD序列与翻译起始密码子之间距离及碱基组成；基因编码区5’端若干密码子碱基序列

核糖体结合位点结构大肠杆菌基因工程第17页核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表示影响SD序列影响：普通来说，mRNA与核糖体结合程度越强，翻译起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为主要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会造成翻译效率大幅度降低

大肠杆菌基因工程第18页核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表示影响SD序列与起始密码子之间序列影响：

SD序列下游碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG翻译效率则分别是最高值50%和25%。紧邻AUG前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶mRNA而言，在这个位置上最正确碱基组合是UAU或CUU，假如用UUC、UCA或AGG取代之，则酶表示水平低20倍大肠杆菌基因工程第19页核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表示影响SD序列与起始密码子之间距离影响：

SD序列与起始密码子之间准确距离确保了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG恰好处于核糖体复合物结构中P位，这是翻译开启前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会造成翻译起始效率不一样程度降低大肠杆菌基因工程第20页核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表示影响起始密码子及其后续若干密码子影响：大肠杆菌中起始tRNA分子能够同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG50%而UUG只及AUG25%。除此之外，从AUG开始前几个密码子碱基序列也至关主要，最少这一序列不能与mRNA5’端非编码区形成茎环结构，不然便会严重干扰mRNA在核糖体上准确定位当前广泛用于外源基因表示大肠杆菌表示型质粒上，均含有与开启子起源相同核糖体结合位点序列，序列和间隔是最正确大肠杆菌基因工程第21页密码子生物体对密码子偏爱性不一样生物，甚至同种生物不一样蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，含有一定偏爱性，其决定原因是：

生物基因组中碱基含量在富含AT生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中，密码子第三位上U和A出现频率较高；而在GC丰富生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C简并密码子占90%以上绝对优势密码子与反密码子相互作用自由能性中等强度规律细胞内tRNA含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；大肠杆菌基因工程第22页密码子密码子偏爱性对外源基因表示影响因为原核生物和真核生物基因组中密码子使用频率含有较大程大差异性，因另外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译一个主要原因是密码子正确选择。普通而言，有两种策略能够使外源基因上密码子在大肠杆菌细胞中取得最正确表示：外源基因全合成同时表示相关tRNA编码基因大肠杆菌基因工程第23页密码子密码子偏爱性对外源基因表示影响按照大肠杆菌密码子偏爱性规律，设计更换外源基因中不宜对应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中高效表示均采取了这种方法外源基因全合成大肠杆菌基因工程第24页密码子密码子偏爱性对外源基因表示影响对于那些含有不友好密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同时克隆表示策略较为有利。比如，在人尿激酶原cDNA412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA丰度较低。为了提升人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中高效表示，将大肠杆菌这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表示质粒上。由此构建大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表示制约作用同时表示相关tRNA编码基因大肠杆菌基因工程第25页质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢影响当前试验室里广泛使用表示型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒扩增过程通常发生在受体细胞对数生长久内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛阶段。质粒分子过分增殖以及其后目标基因高效表示势必会影响受体细胞生长代谢，进而造成重组质粒不稳定性以及目标基因宏观表示水平下降处理上述难题一个有效策略是将重组质粒扩增纳入可控制轨道大肠杆菌基因工程第26页质粒拷贝数质粒扩增时序控制pCP3拥有一个温度可诱导型复制子pCP3PLMCSoriApr在28℃时，每个细胞质粒拷贝数为60在42℃时，拷贝数快速增至300-600在此温度下，受体细胞染色体上CI基因表示温度敏感型阻遏蛋白失活所以，用一个伎俩同时控制质粒拷贝数和基因表示大肠杆菌基因工程第27页C大肠杆菌基因工程菌构建策略6大肠杆菌基因工程包涵体型异源蛋白表示分泌型异源蛋白表示融合型异源蛋白表示寡聚型异源蛋白表示整合型异源蛋白表示蛋白酶抗性或缺点型表示系统构建大肠杆菌基因工程第28页包涵体型异源蛋白表示包涵体及其性质在一些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。富含蛋白质包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成蛋白质往往会丧失其理化特征和生物功效，从而集聚形成包涵体。由高效表示质粒构建大肠杆菌工程菌大量合成非天然性同源或异源蛋白质，后者在普通情况下也以包涵体形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少许DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子大肠杆菌基因工程第29页包涵体型异源蛋白表示以包涵体形式表示目标蛋白优缺点能简化外源基因表示产物分离操作

包涵体表示形式优点：包涵体水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份，菌体经超声波裂解后，直接经过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表示产物结构稳定

在形成包涵体之后，大肠杆菌蛋白酶降解作用基础上对异源重组蛋白稳定性已构不成威胁大肠杆菌基因工程第30页包涵体型异源蛋白表示以包涵体形式表示目标蛋白优缺点包涵体表示形式缺点：以包涵体形式表示重组蛋白丧失了原有生物活性，必须经过有效变性复性操作，才能回收得到含有正确空间构象（因而含有生物活性）目标蛋白，所以包涵体变复性操作效率对目标产物收率至关主要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质成功率相当低，普通不超出30%大肠杆菌基因工程第31页包涵体型异源蛋白表示以包涵体形式表示目标蛋白操作假如未进行特殊设计（如分泌型表示或融合型表示），外源基因在大肠杆菌中表示蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表示产物普通倾向于形成包涵体。所以，以包涵体形式表示目标基因操作关键就是选择高表示载体。实际上，这种高表示率也是包涵体法优点所在大肠杆菌基因工程第32页包涵体型异源蛋白表示包涵体变性与复性操作C

共价修饰蛋白质蛋白质变性复性动力学原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAgI

有效变复性过程中中间状态X

脱离有效变复性过程而进入集聚中间状态N

天然状态蛋白质U

变性状态蛋白质A集聚状态蛋白质在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰蛋白质不能进入复性过程，所以永远成为无活性蛋白质。包涵体中蛋白质就属于这两种状态，所以需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作大肠杆菌基因工程第33页包涵体型异源蛋白表示包涵体变性与复性操作包涵体溶解与变性：包涵体溶解与变性主要任务是拆开错配二硫键和次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性路径中。能有效促进包涵体溶解变性试剂和条件包含：

清洗剂

SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化

促溶剂

盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素廉价，但常被自发形成氰酸盐污染，后者能与多肽链中氨基反应

混合溶剂

如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强

极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应大肠杆菌基因工程第34页包涵体型异源蛋白表示包涵体变性与复性操作包涵体复性与重折叠（refolding）：包涵体复性与重折叠主要任务是：经过次级键形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开游离巯基重新折叠大肠杆菌基因工程第35页包涵体型异源蛋白表示包涵体变性与复性操作包涵体复性与重折叠（refolding）：复性操作包涵体复性操作方法包含：分段稀释法，逐步降低变性剂浓度，预防二次集聚发生一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，将变性蛋白分子固定化，防止其相互碰撞分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表示大肠杆菌基因工程第36页包涵体型异源蛋白表示包涵体变性与复性操作包涵体复性与重折叠（refolding）：二硫键形成在包涵体变性体系中，一直存在着还原剂，使多肽链中巯基保持还原状态，防化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价电子受体为空气，二硫键形成是二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键止二硫键错配造成严重集聚。在变性操作结束后，这些游离型巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键方式主要有：随机，仅适合用于那些不含游离半胱氨酸残基蛋白质重折叠形成相对特异，所以适用性较广，重折叠效果好HSHSSS+2e+2H+AHSHSS-S-RHS+BR-S-S-RSS2R-SH大肠杆菌基因工程第37页分泌型异源蛋白表示在大肠杆菌中表示异源蛋白按其在细胞中定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者经过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列存在是蛋白质分泌前提条件大肠杆菌基因工程第38页分泌型异源蛋白表示以分泌形式表示目标蛋白优缺点分泌表示形式优点：目标蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳稳定性大约是在细胞质中10倍目标蛋白易于分离目标蛋白末端完整相当多真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表示时，蛋白质N端甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠

杆菌信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表示，其N端甲硫氨酸残基便可在信号肽剪切过程中被有效除去大肠杆菌基因工程第39页分泌型异源蛋白表示以分泌形式表示目标蛋白优缺点分泌表示形式缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因极难在大肠杆菌中进行分泌型表示，少数外源基因既便能分泌表示，但其表示率通常要比包涵体方式低很多，所以当前用于产业化异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍大肠杆菌基因工程第40页分泌型异源蛋白表示蛋白质分泌机制原核细菌周质中含有各种分子伴侣可阻止分泌蛋白随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中重组蛋白极少形成份子间二硫键交联，所以与包涵体相比，分泌型重组蛋白含有较高百分比正确构象，生物活性回收率增加，且对蛋白酶不敏感

大肠杆菌基因工程第41页分泌型异源蛋白表示分泌型目标蛋白表示系统构建包含大肠杆菌在内绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上磷酸酯酶，造成细菌内外膜通透性增大。所以，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个适当质粒上即可构建完全分泌型受体细胞。此时，用另一个携带大肠杆菌信号肽编码序列和目标基因表示质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质开启子介导目标基因转录，则可实现目标蛋白从重组大肠杆菌中完全分泌。大肠杆菌基因工程第42页融合型异源蛋白表示除了直接表示异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌本身蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表示。由这种杂合基因表示出蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌蛋白个别位于N端，异源蛋白位于C端。经过在DNA水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，能够在体外从纯化融合蛋白分子中释放回收异源蛋白大肠杆菌基因工程第43页融合型异源蛋白表示以融合形式表示目标蛋白优缺点目标蛋白稳定性高

尤其对分子量较小多肽效果更佳目标蛋白易于分离

利用受体蛋白成熟抗体、配体、底物进目标蛋白表示率高

与受体蛋白共用一套完善表示元件

胞内形成良好空间构象，且大多含有水溶性目标蛋白。在实际生产中，产品主要成本往往就在该工段行亲和层析，能够快速取得纯度较高融合蛋白目标蛋白溶解性好

因为受体蛋白存在，融合蛋白往往能在目标蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和深入分离，才能获大肠杆菌基因工程第44页融合型异源蛋白表示融合型目标蛋白表示系统构建融合蛋白表示质粒构建标准：受体细胞结构基因能高效表示，且其表示产物能够经过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处序列设计十分主要，它直接决定着为目标蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因下游，为融合蛋白提供终止密码子。在一些情况下，并不需要完整受体结构基因，目是尽可能防止融合蛋白分子中两种组份分子量过于靠近，融合蛋白裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致翻译阅读框架大肠杆菌基因工程第45页融合型异源蛋白表示融合型目标蛋白表示系统构建用于融合蛋白构建受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（TrxA）

维持良好空间构象pTrxFus麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫亲和层析pRIT2T外膜蛋白（OmpF）

促进分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）

维持良好空间构象大肠杆菌基因工程第46页融合型异源蛋白表示目标蛋白回收融合蛋白中受体蛋白个别存在可能会影响目标蛋白空间构象和生物活性，假如将之注入人体还会造成免疫反应，所以在制备和生产药用目标蛋白时，将融合蛋白中受体蛋白个别完整除去是必不可少工序。融合蛋白位点专一性断裂方法有两种：

化学断裂法酶促裂解法

大肠杆菌基因工程第47页融合型异源蛋白表示目标蛋白回收用于蛋白位点专一性化学断裂最正确试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中甲硫氨酸残基侧链硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端第一位氨基酸残基保持不变。这一方法优点是回收率高（可到达85%以上），专一性强，而且所产生目标蛋白N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中成熟表示产物较为靠近。然而，假如异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法化学断裂法：大肠杆菌基因工程第48页融合型异源蛋白表示目标蛋白回收酶促裂解法：单残基位点蛋白内切酶切割位点梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假单孢菌蛋白酶Lys-C猪胰蛋白酶Arg-C

Lys-C蛋白酶酶促裂解法特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均含有对应断裂位点决定簇，所以可供选择专一性断裂位点范围较广。几个断裂位点专一性最强商品化蛋白酶分别在多肽链中精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相同。用上述蛋白酶裂解融合蛋白前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，假如外源基因表示产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基出现频率是相当高ArgCNNC受体蛋白目标蛋白大肠杆菌基因工程第49页融合型异源蛋白表示目标蛋白回收酶促裂解法：多残基位点为了克服仅切单一氨基酸残基蛋白酶所带来应用不足，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）人工接头片段，该寡肽为含有蛋白酶活性凝血因子Xa识别和作用序列，其断裂位点在ArgC末端。纯化后融合蛋白用Xa处理，即可取得不含上述寡肽序列目标蛋白。因为Xa识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列概率极少，所以这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不一样大小目标蛋白产物大肠杆菌基因工程第50页融合型异源蛋白表示目标蛋白回收酶促裂解法：多残基位点开启子受体基因接头目标基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表示亲和层析酶解回收大肠杆菌基因工程第51页融合型异源蛋白表示目标蛋白回收酶促裂解法：多残基位点PinpointXatac生物素结合肽编码序列Xa因子识别位点编码序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArg

GluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位点大肠杆菌基因工程第52页寡聚型异源蛋白表示从理论上讲，外源基因表示水平与受体细胞中可转录基因拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它可转录基因，如作为筛选标识抗生素抗性基因等。伴随重组质粒拷贝数不停增加，受体细胞内大个别能量和原料被用于合成全部重组质粒编码蛋白，而细胞正常生长代谢却因能量不济受到影响，所以经过增加质粒拷贝数提升外源基因表示产物产量往往不能取得满意效果。另一个经过增加外源基因剂量而提升目标蛋白产量有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表示载体，即将多拷贝外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表示策略大肠杆菌基因工程第53页寡聚型异源蛋白表示以寡聚形式表示目标蛋白优缺点目标蛋白高效表示在不提升质粒拷贝数前提下，增加目标基因拷贝数，能够稳定表示小分子短肽在一定程度上改进表示量目标产物回收困难短肽因为缺乏有效空间结构，在细菌细胞中半衰期较短。串联短肽含有与蛋白质相同长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解能力大幅度提升寡聚短肽需要裂解和深入分离，才能获最终分子，但裂解后短肽分子轻易出现序列不均一性大肠杆菌基因工程第54页寡聚型异源蛋白表示寡聚型目标蛋白表示系统构建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基础战略：大肠杆菌基因工程第55页寡聚型异源蛋白表示寡聚型目标蛋白表示系统构建构建举例：PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBglIIBamHIEcoRIBamHIBglIIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI+BamHIBglII+BamHIBamHI大肠杆菌基因工程第56页整合型异源蛋白表示以整合形式表示目标蛋白优缺点目标基因稳定表示整合型目标基因随受体细胞染色体DNA复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下能够连续目标基因表示率低单拷贝整合目标基因表示率受到限制，此时可经过强化表示元件而加以赔偿培养而不丢失目标基因表示盒，这对以改良物种遗传性状为目基因工程案例尤其有意义大肠杆菌基因工程第57页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA遗传重组机制，其可能生物学功效是促进生物种群进化。细胞内遗传重组可分为两大类：转位因子依赖型同源序列依赖型大肠杆菌基因工程第58页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理

转位因子是指生物细胞内天然存在一类无复制能力DNA可移动因子，不一样生物种群拥有结构不一样转位因子，比如：转位因子依赖型体内重组：转位因子家族噬菌体 G片段（G-Fragment）原核细菌 插入次序（IS）真核细菌 转座子（Tn、Ty）高等植物可移动因子（Ac、Ds）高等动物 跳跃基因（mobilgene）大肠杆菌基因工程第59页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理转位因子依赖型体内重组：转位因子结构IS（1kb）Ty（5kb）Tn（2-20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗药性基因转位酶基因识别位点阻遏基因IRIRIRIRISIS大肠杆菌基因工程第60页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理转位因子依赖型体内重组：整合形式大肠杆菌基因工程第61页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上两个同源区之间可发生所谓同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间距离同源区长度、同源程度亲密相关。普通地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组频率也就越高，反之亦然。同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者包括两个断裂位点同源序列依赖型体内重组：基础形式大肠杆菌基因工程第62页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理同源序列依赖型体内重组：同源整合ori目标基因同源区域标识基因整合位点染色体DNA大肠杆菌基因工程第63页整合型异源蛋白表示DNA体内重组基础原理同源序列依赖型体内重组：同源交换ori目标基因同源区域标识基因交换区域染色体DNAori标识基因+大肠杆菌基因工程第64页蛋白酶抗性或缺点型表示系统构建不论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目标蛋白表示后都见面临被降解命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短受体细胞内源性蛋白质。在大多数情况下，重组目标蛋白不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统敏感性。然而越来越多试验表明，重组目标蛋白在受体细胞内半衰期能够经过蛋白序列人工设计以及受体细胞改造加以调整和控制。大肠杆菌基因工程第65页蛋白酶抗性或缺点型表示系统构建试验结果表明，大多数不稳定重组目标蛋白是被大肠杆菌中蛋白酶La和Ti降解，二者分别由lon和clp基因编码，其蛋白水解活性依赖于ATP。lon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白过量表示也可作为一个环境压力诱导lon基因表示。lon-大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，所以被广泛用作外源基因高效表示受体菌。蛋白酶缺点型受体细胞改造lon基因缺点大肠杆菌受体（lon-）：大肠杆菌基因工程第66页蛋白酶抗性或缺点型表示系统构建大肠杆菌中庞大热休克蛋白家族对异常或异源蛋白降解也有主要作用，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一个对蛋白酶识别和降解较有利空间构象，从而提升异常或异源蛋白对蛋白酶敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR突变株均展现出对异源蛋白降解作用严重缺点，尤其是lon-htpR-双缺点株，非常适合高效表示各种不稳定重组异源蛋白。蛋白酶缺点型受体细胞改造htpR基因缺点大肠杆菌受体（htpR-）：大肠杆菌基因工程第67页蛋白酶抗性或缺点型表示系统构建大量试验结果表明，在所有极性氨基酸中，天门冬氨酸（Asp）存在对提升蛋白质稳定性效应最显著，而且Asp残基离C末端越近，蛋白质稳定性就越大。更为主要是，在各种结构和功效相互独立蛋白质C末端引入Asp残基，都能显著地延长这些蛋白质半衰期，所以含有普遍意义。抗蛋白酶重组异源蛋白序列设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定性影响：大肠杆菌基因工程第68页蛋白酶抗性或缺点型表示系统构建大量试验结果同时表明，假如多肽链N末端序列中含有较高百分比Ala、Asn、Cys、Gln、His，则蛋白质稳定性显著改进。相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶超敏感区。抗蛋白酶重组异源蛋白序列设计多肽链N末端氨基酸序列对稳定性影响：大肠杆菌基因工程第69页D基因工程菌遗传不稳定性及其对策6大肠杆菌基因工程基因工程菌遗传不稳定性表现与机制改进基因工程菌不稳定性策略大肠杆菌基因工程第70页基因工程菌遗传不稳定性表现与机制工程菌遗传不稳定性表现形式

基因工程菌遗传不稳定性主要表现在重组质粒不稳定性，这种不稳定性含有以下两种表现形式：结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，造成其表观生物学功效丧失分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）大肠杆菌基因工程第71页基因工程菌遗传不稳定性表现与机制工程菌遗传不稳定性产生机制受体细胞中限制修饰系统对外源重组DNA分子降解能量、物质匮乏和外源基因表示产物毒性诱导受体细胞外源基因高效表示严重干扰受体细胞正常生长代谢产生应激反应：关闭合成路径，开启降解程序重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配这是重组质粒逃逸基础原因受体细胞中内源性转座元件促进重组分子缺失重排大肠杆菌基因工程第72页基因工程菌遗传不稳定性表现与机制重组质粒逃逸率一个别细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为当含有重组质粒工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中称为重组质粒宏观逃逸率。重组质粒逃逸原因有：高温培养、表面活性剂（SDS）、药品（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏受体细胞中核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数差异伴随细胞分裂次数增多而加剧大肠杆菌基因工程第73页改进基因工程菌不稳定性策略改进载体受体系统以增大质粒稳定性为目标构建方法包含：将R1质粒上parB基因引入表示型载体中，其表示产物能够选择性地杀死因为分配不均匀所产生无质粒细胞正确设置载体上多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内将受体细胞致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性对应受体系统，如大肠杆菌ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因大肠杆菌基因工程第74页改进基因工程菌不稳定性策略施加选择压力依据载体上抗药性标识，向培养系统中添加对应抗生素药品和食品生产时禁止使用抗生素依据载体上营养缺点型标识，向培养系统中添加对应营培养基复杂，成本较高养组份大肠杆菌基因工程第75页改进基因工程菌不稳定性策略控制目标基因过量表示使用可控型开启子控制目标基因定时表示及表示程度使用可控型复制子控制质粒定时增殖或降低质粒拷贝数优化基因工程菌培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低培养温度有利于重组质粒稳定大肠杆菌基因工程第76页E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素6大肠杆菌基因工程胰岛素结构及其生物合成人胰岛素生产方法重组人胰岛素大肠杆菌工程菌构建大肠杆菌基因工程第77页胰岛素结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内特异性肽酶NC信号肽B肽C肽A肽信号肽酶大肠杆菌基因工程第78页人胰岛素生产方法直接提取法制人胰岛素迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素方法：早期人胰岛素是从人胰脏中直接分离纯化，因为原料供给限制，其产量远远不能满足日益增多糖尿病人临床需求。大肠杆菌基因工程第79页人胰岛素生产方法化学合成法制人胰岛素依据人胰岛素A链和B链序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成路线从技术上来说是能够做到，但其生产成本奇高，从而也限制了产品广泛应用。大肠杆菌基因工程第80页人胰岛素生产方法化学转型法制人胰岛素猪胰岛素可从原料丰富猪胰脏中提取取得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链C末端有一个氨基酸差异，猪为Ala，人为Thr，所以将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一个选择。上述思绪技术路线是：在pH为6-7有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量苏氨酸叔丁酯存在下，将猪胰岛素B链