蛋白类酶的分离纯化

蛋白类酶的分离纯化蛋白类酶的分离纯化第1页1、酶分离纯化原因（3条）2、酶分离纯化判定依据－蛋白质物理化学特征（9条）蛋白类酶的分离纯化第2页内容1、酶提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶提取4、酶分离方法5、酶组合分离纯化策略6、酶浓缩、干燥与结晶蛋白类酶的分离纯化第3页细胞结构与酶分布蛋白类酶的分离纯化第4页3.1酶提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心，过滤、沉淀、层析分离、电泳、萃取、结晶等分离方法蛋白类酶的分离纯化第5页酶纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质

(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；能够粗略去除蛋白质以外物质。(2)个别纯化(partiallypurified):初步纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶

(homogeneous):目标酶进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不一样阶段蛋白类酶的分离纯化第6页3.2细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机蛋白类酶的分离纯化第7页机械破碎捣碎法研磨法匀浆法

物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法

化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法经过机械运动产生剪切力，使组织、细胞破碎。经过各种物理原因作用，使组织、细胞外层结构破坏，而使细胞破碎。经过各种化学试剂对细胞膜作用，而使细胞破碎经过细胞本身酶系或外加酶制剂催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而到达细胞破碎细胞破碎方法及其原理蛋白类酶的分离纯化第8页酶提取是指在一定条件下，用适当溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中过程。也称为酶抽提。酶提取时首先应依据酶结构和溶解性质，选择适当溶剂。普通说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多非极性基团，则可用有机溶剂提取。

3.3酶提取蛋白类酶的分离纯化第9页

提升温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提升酶分子扩散速度，从而增大提取效果。为了提升酶提取率并预防酶变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。蛋白类酶的分离纯化第10页为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含成份控制溶液pH值缓冲对；控制溶液离子强度无机盐；控制溶液氧化还原状态还原剂；蛋白酶抑制剂离子螯合剂标准牛血清白蛋白去污剂水和防腐剂甘油蛋白类酶的分离纯化第11页酶主要提取方法提取方法使用溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大酶酸溶液提取PH2～6水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性很好酶碱溶液提取PH8～12水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性很好酶有机溶剂提取可与水混溶有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢靠或含有较多非极性基团酶蛋白类酶的分离纯化第12页

大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度盐存在条件下，酶溶解度随盐浓度升高而增加，这称为盐溶现象。蛋白类酶的分离纯化第13页3.4酶分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离5、电泳分离6、萃取分离蛋白类酶的分离纯化第14页1、沉淀分离沉淀分离是经过改变一些条件或添加某种物质，使酶溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离技术过程。沉淀分离方法分离原理

盐析沉淀法利用不一样蛋白质在不一样盐浓度条件下溶解度不一样特征，经过在酶液中添加一定浓度中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不一样两性电解质有不一样等电点这一特征，经过调整溶液pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中溶解度不一样，经过添加一定量某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入一些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定条件使酶液中存在一些杂质变性沉淀，而不影响所需酶，从而使酶与杂质分离蛋白类酶的分离纯化第15页在盐浓度到达某一界限后，酶溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。盐析主要原理在于高浓度盐离子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋白质分子表面水化膜，同时因为反离子作用，也影响蛋白质分子所带电荷

蛋白类酶的分离纯化第16页

在一定温度和pH值条件下（β为常数），经过改变离子强度使不一样酶或蛋白质分离方法称为Ks分段盐析；而在一定盐和离子强度条件下（KsI为常数），经过改变温度和pH值，使不一样酶或蛋白质分离方法，称为β分段盐析公式logS=logS0-KsI=β-KsI蛋白类酶的分离纯化第17页

在蛋白质盐析中，通常采取中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常见。这是因为硫酸铵在水中溶解度大而且温度系数小，不影响酶活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子存在会干扰蛋白质测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵浓度通常以饱和度表示（指溶液中加入饱和硫酸铵体积与混合溶液总体积比值）解读蛋白质工程p204页表7－3蛋白类酶的分离纯化第18页

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是因为有机溶剂存在会使溶液介电常数降低。比如，20℃时水介电常数为80，而82％乙醇水溶液介电常数为40。

溶液介电常数降低，就使溶质分子间静电引力增大，相互吸引而易于凝集，同时，对于含有水膜分子来说，有机溶剂与水相互作用，使溶质分子表面水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常见于酶沉淀分离有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等蛋白类酶的分离纯化第19页蛋白类酶的分离纯化第20页2、离心分离

离心分离是借助于离心机旋转所产生离心力，使不一样大小、不一样密度物质分离技术过程。在离心分离时，要依据欲分离物质以及杂质颗粒大小、密度和特征不一样，选择适当离心机、离心方法和离心条件。

常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在酶分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物分离。也用于酶结晶等较大颗粒分离。蛋白类酶的分离纯化第21页高速离心机最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力到达1×104～1×105g，在酶分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等分离。有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机超速离心机最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力能够高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等分离纯化；样品纯度检测；沉降系数和相对分子质量测定等。蛋白类酶的分离纯化第22页超速离心有三种：差速离心：采取不一样离心速度和离心时间，使不一样沉降速度颗粒分批分离方法密度梯度离心：使沉降系数比较靠近物质得以分离一个区带分离方法。必须预先配制好适宜密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制备好密度梯度溶液表面。（密度相近，分子量不一样）梯度较浅，密度较低等密度梯度离心：分离密度不一样颗粒，欲分离颗粒处于密度梯度中等密度点（平衡）才可停顿离心，操作时先把一定浓度介质溶液与样品液混合均匀。（密度不一样，分子量相近）梯度陡峭，密度较高蛋白类酶的分离纯化第23页密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度梯度系统，贮液室与混合室截面积关系决定梯度类型。配制中，将稀溶液置于贮液室B，浓溶液置于混合室A,如图4-2(郭勇酶工程p96）流出梯度液经过导管小心搜集于离心管，假如浓溶液置于贮液室B，稀溶液置于A室，梯度液导液管必须直插到离心管管底，让以后流入浓度高混合液将先流入浓度较低混合液顶浮起来形成由管口到管底逐步升高密度梯度蛋白类酶的分离纯化第24页蛋白类酶的分离纯化第25页蛋白类酶的分离纯化第26页

超速离心机按照其用途能够分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状

等，均会影响其沉降速率，沉降系数即用来描述此沉降性质；其单位为

S

(Svedbergunit)。

每一种沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不一样沉降系数蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分离。蛋白类酶的分离纯化第27页3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不一样大小、不一样形状物质分离技术过程。过滤介质各种多样，常见有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，能够依据需要选取。过滤非膜过滤：采取高分子膜以外物质作为过滤介质

膜过滤：采取各种高分子膜为过滤介质

蛋白类酶的分离纯化第28页过滤分类及其特征(依据过滤介质截留物质颗粒大小不一样

)

类别截留颗粒大小截留主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜蛋白类酶的分离纯化第29页

借助于一定孔径高分子薄膜，将不一样大小、不一样形状和不一样特征物质颗粒或分子进行分离技术称为膜分离技术。膜分离所使用薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成高分子膜。有时也能够采取动物膜等。膜分离过程中，薄膜作用是选择性地让小于其孔径物质颗粒或分子经过，而把大于其孔径颗粒截留。膜孔径有各种规格可供使用时选择蛋白类酶的分离纯化第30页。膜分离加压膜分离

微滤超滤反渗透电场膜分离

电渗析离子交换膜电渗析

扩散膜分离透析蛋白类酶的分离纯化第31页依据膜材料和不一样进料液特征，商品应用膜产品通常采取以下几个结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。蛋白类酶的分离纯化第32页膜技术

截留物尺寸nm（分子量）

推进力

分离机理微滤MF

>20(>40,000)

压力差，>100kPa

筛分超滤UF

1～20(10,000--40,000)

压力差>100kPa

筛分纳滤NF

>1(100～1000)

压力差，<1000kPa优先吸附、表面电位反渗透RO

(>100)

压力差，>1000kPa

优先吸附、溶解扩散

四种常见膜分离技术基础特征

蛋白类酶的分离纯化第33页四种常见膜分离过程截留特征蛋白类酶的分离纯化第34页4、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一个物理分离方法。它是利用混合物中各组分物理化学性质差异，使各组分以不一样程度分布在两个相中，其中一个相为固定(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不一样速度移动，从而到达分离。蛋白类酶的分离纯化第35页

层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样而使混合物中各组分分离（分子表面特征）分配层析利用各组分在两相中分配系数不一样，而使各组分分离（溶解度）离子交换层析利用离子交换剂上可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不一样而抵达分离目标（带电性质）凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不一样而抵达物质分离（分子大小）亲和层析利用生物分子与配基之间所含有专一而又可逆亲和力，使生物分子分离纯化（分子形状）层析聚焦将酶等两性物质等电点特征与离子交换层析特征结合在一起，实现组分分离蛋白类酶的分离纯化第36页吸附层析

吸附层析是利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样而使混合物中各组分分离方法吸附层析通常采取柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不停发生解吸、吸附、再解吸、再吸附过程蛋白类酶的分离纯化第37页。

蛋白类酶的分离纯化第38页溶剂洗脱法－采取单一或混合溶剂进行洗脱，各组分按照由弱到强次序先后流出，以洗脱液对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。若两峰重合或拖尾现象出现，可采取按一定规律改变pH梯度或浓度梯度洗脱置换洗脱法－置换洗脱液中有一吸附力比被吸附组分更强物质取代被吸附成份，后者按照吸附力由弱到强次序流出，以洗脱液对组分浓度作图，可得到阶梯式洗脱曲线前缘洗脱法－用含有各组分混合溶液本身作洗脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附力最弱组分开始最先流出。其洗脱曲线即使也呈阶梯型，但只有吸附力最弱组分得以和其它组分分离，仅用于分析前缘组分分析蛋白类酶的分离纯化第39页分配层析定义：分配层析是利用各组分在两相中分配系数不一样，而使各组分分离方法分配系数：是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数蛋白类酶的分离纯化第40页

在分配层析中，通常采取一个多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一个溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中一直固定在多孔支持物上。另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续动态分配蛋白类酶的分离纯化第41页按固定相介质分

纸上层析分配薄层层析分配气相层析分配层析按固定相极性不一样分为

正相分配层析（极性溶剂为固定相）

反相分配层析（非极性有机溶剂为固定相）蛋白类酶的分离纯化第42页离子层析离子交换层析是利用离子交换剂上可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不一样而到达分离目标一个层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团不溶性高分子物质。经过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。蛋白类酶的分离纯化第43页离子交换层析介质由三个别组成：惰性支持物；带电基团；（带电基团）平衡离子通常所说离子交换实际上是蛋白质分子与平衡离子间相互交换，他们共同竞争离子交换层析介质中带电基团阳离子交换层析－平衡离子为阳离子，层析介质带电基团带有负电阴离子交换层析－平衡离子为阴离子，层析介质带电基团带有正电蛋白类酶的分离纯化第44页1、离子交换剂选择应依据欲分离组分特征和要求，过强吸附以及极端洗脱条件都可能造成活性分子变性失活；另外溶液pH直接决定离子交换剂活性基团及组分离子解离程度，从而影响了离子交换剂交换容量和交换选择性蛋白类酶的分离纯化第45页

选择离子交换剂时考虑原因：

1）离子交换剂和组分离子物理化学性质；

2）组分离子所带电荷种类；

3）溶液中组分离子浓度高低；

4）组分离子质量大小；

5）组分离子与离子交换剂亲和力大小蛋白类酶的分离纯化第46页2、离子交换剂处理

1）溶胀、洗涤至澄清；

2)4V2mol/LHCl进行酸处理，洗涤；

3)4V2mol/LNaOH进行碱处理，洗涤；

4）装柱

5）用适当试剂进行转型处理，使离子交换剂上所带可交换离子转变为所需离子比如，阳离子交换剂（如）用NaOH处理，转变为Na+型，用HCl处理，转变为H+型；阴离子交换剂用NaOH处理，转变为OH-型，用HCl处理转变为Cl-型蛋白类酶的分离纯化第47页

离子交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，一些大孔径离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于酶分离纯化。离子交换层析介质吸附蛋白量很大，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗处理好离子交换剂能够在交换槽中进行分批离子交换，也能够将离子交换剂装进离子交换柱进行连续离子交换蛋白类酶的分离纯化第48页离子层析分离过程包含1、装柱：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、无气泡、无裂缝离子交换柱2、上柱:转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将欲分离混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液中盐离子浓度不能过高、还要注意混合液温度和pH值上柱时要控制适当流速3、洗脱：洗脱液应该含有与离子交换剂亲和力较大离子，要经过试验确定洗脱流速。洗脱过程中，组分离子按照与交换剂亲和力由大到小次序先后洗出。对多组分为到达良好分离效果，常见浓度梯度或pH梯度洗脱法，每一个又可选取阶段梯度洗脱或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。蛋白类酶的分离纯化第49页离子层析分离过程包含4、搜集：与离子层析柱亲和力最小组分先流出，经过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在280nm光吸收值，同时用个别搜集器搜集。以洗脱体积为横坐标，以280nm光吸收值为纵坐标，绘制洗脱曲线。依据洗脱峰位置，确定不一样大小蛋白质所在试管，深入用电泳伎俩判定目标蛋白5、交换剂再生：酸－碱－酸处理碱－酸－碱处理蛋白类酶的分离纯化第50页蛋白类酶的分离纯化第51页凝胶层析

凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不一样而到达物质分离一个层析技术蛋白类酶的分离纯化第52页凝胶层析基础原理凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质因为分子直径大，不能进入凝胶微孔，只能分布于凝胶颗粒间隙中，以较快速度流过凝胶柱。较小分子能进入凝胶微孔内，不停地进出于一个个颗粒微孔内外，这就使小分子物质向下移动速度比大分子速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小次序先后流出层析柱，而到达分离目标蛋白类酶的分离纯化第53页为了定量地衡量混合液中各组分流出次序，经常采取分配系数Ka来量度

Ve

洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰出现时，所需洗脱液体积；Vo

外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间体积VI

内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔体积Ka＝Ve-V0VI蛋白类酶的分离纯化第54页假如某组分分配系数Ka=0，即Ve=Vo，说明该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；假如某组分分配系数Ka=1，即Ve=Vo+VI，说明该组分能够自由地扩散进入到凝胶颗粒内部全部微孔，洗脱是最终流出；假如某组分分配系数Ka在0～1，说明该组分分子大小介乎大分子和小分子之间，能够进入凝胶微孔，不过扩散速度较慢，洗脱时按照Ka值由小到大次序先后流出。

蛋白类酶的分离纯化第55页蛋白类酶的分离纯化第56页在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且Ve=Vo+VI，全部组分都应该被洗脱出来，Ka最大值为1当Ka大于1时，说明此层析不是单纯凝胶层析，还存在吸附层析或离子交换层析对同一类型化合物，凝胶层析洗脱特征与组分相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子质量由大到小次序先后流出。Ve=K1-K2lgM蛋白类酶的分离纯化第57页在实际应用中，常以相对洗脱体积Kav对lgM作曲线，称为选择曲线相对洗脱体积是指组分洗脱体积与层析柱内凝胶床总体积之比值Kav＝Ve/Vt蛋白类酶的分离纯化第58页lgMKav3.54.04.55.05.56.001.00.5选择曲线斜率说明凝胶特征。每一类型化合物都有其各自特定选择曲线。如此图所表示，能够经过凝胶层析测定物质相对分子质量蛋白类酶的分离纯化第59页凝胶选择与处理

常见凝胶材料主要有葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，层析用微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交联剂有环氧氯丙烷选择凝胶主要是依据欲分离组分分子质量大小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液流速有一定影响，应选择大小比较均匀商品凝胶，使用前需将凝胶于洗脱液中充分溶胀。溶胀通常采取热水溶胀（2－3小时），这么也到达消毒和排出凝胶内气泡目标溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排气即可装柱蛋白类酶的分离纯化第60页凝胶层析操作过程凝胶层析操作普通包含装柱、上柱、洗脱等过程装柱：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边迟缓而连续地加入浓稠凝胶悬浮液，让其自然沉降，分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后洗脱液浸没凝胶表面。上柱：在洗脱液液面恰好与凝胶床表面相平时加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积10%左右，浓度可高些，黏度应低。洗脱：洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使用一致，体积普通为凝胶床体积120%，洗脱流出液分步搜集。蛋白类酶的分离纯化第61页凝胶层析操作过程（详见蛋白质工程p213）

洗脱完成后，凝胶柱已经恢复酶液上样前状态，不需再生处理就能够重复进行下一批分离纯化。假如使用次数较多，或要纯化不一样品时，用2－3倍柱体积非离子去污剂除去吸附在凝胶中杂质，或卸下凝胶，用0.2mol/LNaOH浸泡，再水洗。然后加入20%乙醇或0.04%NaN3在4－8℃长久保留蛋白类酶的分离纯化第62页亲和层析亲和层析是利用生物分子与配基之间所含有专一而又可逆亲和力，而使生物分子分离纯化技术。酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶RNA与互补RNA分子或片段、RNA与互补DNA分子或片段等之间，都是含有专一而又可逆亲和力生物分子对。故此,亲和层析在酶分离纯化中有主要应用蛋白类酶的分离纯化第63页亲和层析技术特点是选择性很高，可降低提纯步骤在亲和层析中,作为固定相一方称为配基(Ligand)，配基必须偶联于不溶性母体(Matrix)上，母体又称为载体或担体。普通采取琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素作母体当小分子物质(金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等)作为配基时，因为空间位阻作用，难以与配正确大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度连接臂（spacearm）

蛋白类酶的分离纯化第64页要使不溶性母体与配基偶联或经过连接臂与配基偶联，都必须进行母体活化。即经过某种方法，如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功效试剂法等，使母体引入某种活泼基团，才能以共价键与配基偶联因为亲和结合专一性强，洗脱条件要求高。在亲和层析过程中，应控制好温度（0－10℃）、pH等条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化后期使用蛋白类酶的分离纯化第65页蛋白类酶的分离纯化第66页亲和层析四个要素蛋白类酶的分离纯化第67页常见亲和介质及专一性配体蛋白类酶的分离纯化第68页依据欲分离组分与配基结合特征,亲和层析能够分为：

共价亲和层析 疏水层析(要区分疏水层析与反相层析)

金属离子亲和层析（试验方法见蛋白质工程p218） 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析

蛋白类酶的分离纯化第69页金属离子亲和层析

金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白表面组氨酸咪唑基团、半胱氨酸巯基基团、色氨酸吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和结合特征，用螯合在母体上金属离子对混合液中目标蛋白进行纯化。要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，可改变盐浓度或pH（降低金属离子和蛋白质间亲和常数），或采取竞争性试剂将蛋白置换下来，可采取分级洗脱或梯度洗脱方式金属离子亲和层析主要优点是可用不一样金属离子结合到螯合载体上，实现母体再生。蛋白类酶的分离纯化第70页

层析聚焦－将酶等两性物质等电点特征与离子交换层析结合在一起，实现组分分离层析技术蛋白类酶的分离纯化第71页5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反电极移动过程称为电泳。颗粒在电场中移动速度主要决定于其本身所带净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小影响。另外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体特征等外界条件影响。蛋白类酶的分离纯化第72页纸电泳自由电泳薄层电泳凝胶电泳薄膜电泳等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖电泳连续凝胶电泳梯度凝胶电泳不连续凝胶电泳SDS-凝胶电泳电泳蛋白类酶的分离纯化第73页制备式电泳通常以不含SDS原态disc进行，方便回收含有活性蛋白质；蛋白质样本要先经过个别纯化，不然效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶位置。蛋白类酶的分离纯化第74页蛋白类酶的分离纯化第75页电极缓冲液应依据欲分离组分而定。一个为阴离子电泳系统，缓冲液pH为8－9，上槽接负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适合用于普通蛋白质和核酸分离；一个为阳离子电泳系统，缓冲液pH为4左右，上槽接正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适合用于碱性蛋白质电泳分离电泳试验方法主要要求看SDS－PAGE和双向电泳（详见《蛋白质工程》p220-223）凝胶层析详见《蛋白质工程》p213金属离子亲和层析见《蛋白质工程》

p218蛋白类酶的分离纯化第76页高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊高效液相色谱柱，它使用基质珠更小，孔径更均一，基质填充比常规层析柱更致密，所以能够耐受更大压力，采取更加快洗脱速度，含有更高分辨率和重复性。高效液相色谱依据凝胶介质分离原理不一样，又可分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高效疏水色谱、高效亲和色谱蛋白类酶的分离纯化第77页6、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中溶解度不一样而使其分离技术。萃取分离中两相普通为互不相溶两个液相。有时也可采取其它流体。按照两相组成不一样，萃取能够分为：

有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取

蛋白类酶的分离纯化第78页有机溶剂萃取在酶萃取过程中，有机溶剂要预冷至0－10℃，萃取过程在0－10℃低温条件下进行，并尽可能缩短酶与有机溶剂接触时间蛋白类酶的分离纯化第79页双水相萃取

双水相系统普通是指将两种亲水性聚合物都加在水溶液中，当超出某一浓度时，产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶两相中（每种聚合物在上下相中分配比率不一样）成相是因为聚合物分子空间妨碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而含有相分离倾向。双水相形成条件和定量关系可用相图表示，对于两种聚合物和水相组成系统，其相图如图4-8所表示。蛋白类酶的分离纯化第80页各种双水相系统聚合物P

聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠蛋白类酶的分离纯化第81页图4－7双水相系统相图在双节线TCB下方区域是单相区，上方是双相区。T点和B点分别表示到达平衡时上相组成和下相组成，在同一直线上各点分成两相，含有相同组成，但体积比不一样当系线TMB下移，长度减小，两相之间差异逐步减小，到达临界点C点时，系线长度为零，到达均相。聚合物P%B´TBCT´聚合物Q或盐%M蛋白类酶的分离纯化第82页双节线位置和形状与聚合物分子质量相关，聚合物分子质量越高，相分离所需浓度越低。在高分子聚合物上引入亲和配基，能够进行双水相亲和萃取双水相萃取不足：分离后酶液浓度低高分子聚合物在分离后需要分离除去蛋白类酶的分离纯化第83页超临界萃取

超临界萃取又称超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度不一样而到达分离一个萃取技术在相同压力和温度条件下，同一物质液相和气相物理特征是截然不一样。当温度和压力到达某一特定数值时，气体和液体物理特征就会趋于相同，这个数值称为超临界点。当温度和压力超出其超临界点时，两相变为一相，这种状态下流体称为超临界流体蛋白类酶的分离纯化第84页pTGLSSCF图4-8超临界系统相超临界流体显著特点：①其物理特征和传质特征介于液体和气体之间，适于作萃取溶剂；②其含有和液体一样溶解能力，含有很高萃取速度；③随温度和压力改变，其对物质萃取含有选择性，萃取后易分离；④其黏度靠近于气体黏度，利于物质扩散；蛋白类酶的分离纯化第85页作为萃取剂超临界流体必须具备以下条件：具备良好化学稳定性，对设备没腐蚀性；临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温度附近；操作温度应低于被萃取溶质分解温度；临界压力不能太高，节约压缩动力；选择性要好，轻易制得高纯度制品；溶解度要高，可降低溶剂循环量；萃取剂要轻易取得，价格廉价蛋白类酶的分离纯化第86页CO2超临界萃取工艺工程由萃取和分离两个步骤组成，按分离方法不一样，分离工艺过程分为：等压分离：压力相同，温度升高，溶质在CO2中溶解度降低而分离析出分离等温分离：温度相同，压力下降，溶质在CO2中溶解度降低而分离析出吸附分离：温度压力不变，分离罐中吸附剂吸附溶质而分离溶质在超临界流体萃取中，为提升分离效果，在超临界流体中添加少许另一溶剂，称为夹带剂，如水、乙醇、丙酮。蛋白类酶的分离纯化第87页一些超临界流体超临界点和超临界密度流体名称临界温度(℃)临界压力(Mpa)临界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳CO231.17.380.46二氧化硫SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑气N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.578