重组蛋白的分离纯化

关于重组蛋白的分离纯化基因表达体系1.

原核体系2.

真核体系第2页,共105页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌(Escherichiacoli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰第3页,共105页，2024年2月25日，星期天枯草杆菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体第4页,共105页，2024年2月25日，星期天其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆(Bacillusthuringiensis)第5页,共105页，2024年2月25日，星期天真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织第6页,共105页，2024年2月25日，星期天酵母细胞可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：

酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;

毕赤酵母(Pichiapastoris);

裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）第7页,共105页，2024年2月25日，星期天昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可第8页,共105页，2024年2月25日，星期天CHO细胞可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高第9页,共105页，2024年2月25日，星期天动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长第10页,共105页，2024年2月25日，星期天鸟类输卵管组织分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同第11页,共105页，2024年2月25日，星期天植物组织植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便第12页,共105页，2024年2月25日，星期天体系选择研究基因功能:

大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:

大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:

大肠杆菌,酵母,

大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:

杂交瘤细胞工业酶生产:

各种微生物

第13页,共105页，2024年2月25日，星期天重组蛋白的分离纯化策略

重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择第14页,共105页，2024年2月25日，星期天针对不同的产物表达形式采取不同的策略

采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。第15页,共105页，2024年2月25日，星期天针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型

等电点处于极端区域（pI≤5

或

pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；

重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4

mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。第16页,共105页，2024年2月25日，星期天多种分离纯化技术的联合运用

在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段第17页,共105页，2024年2月25日，星期天合适分离纯化介质的选择

常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉第18页,共105页，2024年2月25日，星期天ProteinpurificationPreparationofthebacteriallysateItisacriticalstep.Optimalconditionsmaximizecelllysisandthefractionoftherecombinantproteinthatisextractedwhileminimizingproteinoxidation,unwantedproteolysisandsamplecontaminationwithgenomicDNA.Thelysisbuffershouldcontainastrongbuffertoovercomethecontributionofthebacteriallysate,highionicstrengthtoenhanceproteinsolubility,proteaseinhibitorsandareducingagentsuchasTECPtopreventoxidationoftheprotein.第19页,共105页，2024年2月25日，星期天AboutgelfiltrationThechoiceofgelfiltrationasthenextstepafterIMACmaybesurprising,consideringitslowerresolvingpowercomparedwithionexchangeorotheradsorptionchromatographymethods,butthisstepisoftensufficientafterIMACiftheproteinwasabundantinthelysate.Moreover,gelfiltrationismoregeneric,canbeperformedinanybuffercondition,andcanbeusedtoresolvetheoligomerizationstateofthetargetprotein.Superdex75andSuperdex200prepgrade,XK16/60columnsaremostusefulfor1-30mgofproteininasamplevolumeofupto7.5ml.第20页,共105页，2024年2月25日，星期天第21页,共105页，2024年2月25日，星期天分泌型战略表达重组蛋白的分离纯化策略要分泌的多肽有一个疏水的氨基突出，它负责向内质网的转运这个末端突出通常由大约20个氨基酸组成，并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细胞分泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多数情况下都用到了a-因子信号序列。第22页,共105页，2024年2月25日，星期天外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入15～30个氨基酸组成的信号肽（signalpeptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：①分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。第23页,共105页，2024年2月25日，星期天②分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。③简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。第24页,共105页，2024年2月25日，星期天人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究1、重组载体的构建特导引物设计，以pBV220-ALR质粒为模板扩增目的条带构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母GS115重组蛋白的表达及鉴定rhALR的纯化第25页,共105页，2024年2月25日，星期天rhALR的纯化菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-SepharoseFF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分脱盐后再上DEAE-SepharoseFF柱，然后再用SephadesG-75柱进一步纯化。第26页,共105页，2024年2月25日，星期天离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6B

DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积。第27页,共105页，2024年2月25日，星期天离子交换介质的选择原则对pI=5的某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0的范围内，应首选DEAE纤维素；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5的范围内，应首选CM纤维素12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）第28页,共105页，2024年2月25日，星期天Whathappensinionexchange?sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead第29页,共105页，2024年2月25日，星期天++++++-------equilibrationanionexchangerbead第30页,共105页，2024年2月25日，星期天-----------++++++----sampleapplicationandwash第31页,共105页，2024年2月25日，星期天----------------------------------++++++++++++--elution第32页,共105页，2024年2月25日，星期天-----------------------++++++regeneration第33页,共105页，2024年2月25日，星期天离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要第34页,共105页，2024年2月25日，星期天离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数第35页,共105页，2024年2月25日，星期天离子交换层析的基本操作样品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090分子浓度离子强度pH值第36页,共105页，2024年2月25日，星期天阴离子交换法色谱条件：DEAE-SepharoseFF阴离子交换填料；XK26/20色谱柱，体积89.32ml;8ml/min;0.2灵敏度A液：5ommol/LTris-Hcl(pH8.0)B液：50mmol/LTris-Hcl+1mol/NaCl(pH8.0)以A液为平衡液，B液为100%洗脱液，各洗脱浓度由PharmaciaFPLC系统自动将A液和B液混合产生。第37页,共105页，2024年2月25日，星期天阴离子交换层析：透析上清超过饱和吸附量上样后，目的蛋白主要集中在0.1mol/LNaCl洗脱峰，但还含有很多杂质；在1mol/LNaCl洗脱峰中只存在少量目的蛋白超饱和上样的0.1mol/LNaCl洗脱峰脱盐后再上样，目的蛋白集中在0.2mol/LNaCl洗脱峰，杂质含量已较少。第38页,共105页，2024年2月25日，星期天第39页,共105页，2024年2月25日，星期天凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本操作第40页,共105页，2024年2月25日，星期天凝胶层析的基本原理

凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。第41页,共105页，2024年2月25日，星期天凝胶介质的基本性质葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温葡聚糖凝胶（Sephadex）SephadexLH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶

质的凝胶过滤

第42页,共105页，2024年2月25日，星期天凝胶介质的选用原则将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用SephadexG-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用SephadexG-10、G-组别分离15、Bio-GelP-2或P-4第43页,共105页，2024年2月25日，星期天将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。第44页,共105页，2024年2月25日，星期天凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定恒定的操作压是恒流的先决条件第45页,共105页，2024年2月25日，星期天上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好第46页,共105页，2024年2月25日，星期天凝胶色谱层析色谱条件：SephadexG-75凝胶填料；XK16/80色谱柱，体积160.75ml;1ml/min;0.2灵敏度。洗脱液：0.9%NaCl(pH5.5)第47页,共105页，2024年2月25日，星期天洗脱第1峰主要为rhALR四聚体；洗脱第2峰为目的蛋白峰，rhALR二聚体，纯度大于95%，rhALR最后得率为52%。第48页,共105页，2024年2月25日，星期天包涵体型战略表达重组蛋白的分离纯化策略包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体存在部位：细胞质、细胞周质第49页,共105页，2024年2月25日，星期天包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。包涵体形成的本质——是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：①折叠状态的蛋白质的聚集作用；②非折叠状态的蛋白质的聚集作用；③蛋白质折叠中间体的作用。第50页,共105页，2024年2月25日，星期天当重组蛋白以包涵体形式存在时，可获得高表达、高纯度的重组蛋白，避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但不具有生物活性。

要对其进行分离纯化，就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白。其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异。即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。由于包涵体难溶，必须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化，可以用变性剂(尿素或盐酸胍)溶解包涵体，这样获得的重组蛋白产量虽高，却会破坏蛋白质的二级结构，需经蛋白复性才可能恢复它的生物活性。包涵体的分离纯化第51页,共105页，2024年2月25日，星期天主要方法金属亲和层析凝胶过滤层析离子交换层析疏水层析双水相萃取技术反胶团相转移技术第52页,共105页，2024年2月25日，星期天Interactionbetweenneighboringresiduesinthe6

HistagandNi-NTAmatrix第53页,共105页，2024年2月25日，星期天第54页,共105页，2024年2月25日，星期天第55页,共105页，2024年2月25日，星期天PurificationmechanismofrecombinantHis-tagged

proteinsAdvantages:easytoidentifyandpurify第56页,共105页，2024年2月25日，星期天人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化1原核表达载体的构建pUC118-cycDpET-28c(+)EcoRIT4DNA连接酶pET-28c-cycDDH5α,鉴定克隆子阅读框架的正确性第57页,共105页，2024年2月25日，星期天第58页,共105页，2024年2月25日，星期天2融合基因在大肠杆菌中的诱导表达pET-28c-cycD提取质粒，转入BL21表达宿主30μg/mlKan,LB37℃过夜培养，之后按1：100转接OD600=0.6IPTG=0.1mmol/L诱导表达，每隔1小时取样，确定最佳时间为4小时第59页,共105页，2024年2月25日，星期天pET-28c-cycD转化的菌株经IPTG诱导后在分子量约43000处出现一条蛋白条带。灰度扫描分析表明目的基因在IPTG诱导4h后表达量最大，约占菌体总蛋白的23％。分别对表达菌体的裂解上清和沉淀进行12％SDS分析，发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，说明表达的CyclinD1蛋白以包涵体形式存在。第60页,共105页，2024年2月25日，星期天3包涵体的洗涤与变性大量诱导表达后，离心收集菌体0.1倍培养物体积的溶液A悬浮超声裂菌4000g于4℃

离心15min，回收的沉淀即为粗制包涵体0.5％TritonX-100和2mol／L尿素的磷酸缓冲液依次洗涤悬于溶液B搅拌溶解1h12500g，30min离心，收集上清第61页,共105页，2024年2月25日，星期天溶液A：20mmol/L磷酸钠，500mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，0.1mmol/LPMSF，1mmol/L巯基乙醇，pH=7.4磷酸缓冲液:20mmol/L磷酸钠,500mmol/LNaCl，pH=7.4溶液B:8mol/L尿素，20mmol/L磷酸钠500mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，0.1mmol/LPMSF，1mmol/L巯基乙醇，pH=7.4第62页,共105页，2024年2月25日，星期天重组菌制备包涵体经洗涤后，用8mol/L尿素变性，加到HisTrapHPNi螫合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。洗脱蛋白经12％的SDS—PAGE分析表明，纯化的表达产物在分子量430o0处显示出一条蛋白带，凝胶薄层扫描分析纯度达98％以上。第63页,共105页，2024年2月25日，星期天4目的蛋白的亲和层析纯化和复性变性上清微孔滤膜过滤预先用溶液B平衡过HisTrapHP柱l0倍柱体积的缓冲液Bl0倍柱体积的缓冲液C洗柱5倍柱体积缓冲液D特异性洗脱，分步收集，每管约1mL第64页,共105页，2024年2月25日，星期天缓冲液C：缓冲液B中含20mmol/L咪唑缓冲液D:缓冲液B中含500mmol/L咪唑第65页,共105页，2024年2月25日，星期天收集液进行12％的SDS检测合并含有目的蛋白的各管样品，适当稀释，装入透析袋复性含6mol／L尿素的磷酸缓冲液4℃透析过夜分别用4mol/L,3mol/L,2mol/L,1mol/L,0.5mol/L的梯度透析各4h以上PBS缓冲液透析过夜蛋白溶液在44℃下12500g离心20min上清即为可溶性复性蛋白，冻干后备用第66页,共105页，2024年2月25日，星期天纯化的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的分段透析复性方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，获得复性的重组CyclinD1蛋白的纯度达-98％以上．第67页,共105页，2024年2月25日，星期天Westernblot检测表达产物BL21(DE3)菌裂解液,诱导4h的转化菌裂解液,纯化的融合蛋白SDS电转移至硝酸纤维素(NC)膜上封闭抗CyclinD1单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG进行孵育二氨基联苯二胺(DAB)显色第68页,共105页，2024年2月25日，星期天第69页,共105页，2024年2月25日，星期天融合表达蛋白的分离纯化

与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。第70页,共105页，2024年2月25日，星期天第71页,共105页，2024年2月25日，星期天第72页,共105页，2024年2月25日，星期天表达融合蛋白的优点(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。(5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。第73页,共105页，2024年2月25日，星期天节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化GST结合位点第74页,共105页，2024年2月25日，星期天GST-融合蛋白的表达和纯化流程第75页,共105页，2024年2月25日，星期天结核分枝杆菌16kDa与GST融合表达及纯化1、16kDa基因的扩增与表达载体的构建设计带有酶切位点的上下游引物5’-TCAGAATTCATGAAGCTCACCACAATGA-3’(EcoRI)5’-TCACTCGACCTACGGCTCCCAAATCAGC-3’(SalI)扩增目的基因双酶切产物及载体pGEX-6P-1连接转化大肠杆菌DH5a及JM109感受态细胞双酶切及测序验证第76页,共105页，2024年2月25日，星期天第77页,共105页，2024年2月25日，星期天第78页,共105页，2024年2月25日，星期天2、融合蛋白在大肠杆菌中的表达挑取阳性克隆接种于LA培养基活化37℃，200r/min,6h分别取50

μL转接于5mLLA37℃,OD6000.5-0.8加入IPTG1mmol/L

每隔1h收集菌体重悬菌体SDS检测取少量培养物，离心收集沉淀（作为空白对照）37℃，230r/min,3h第79页,共105页，2024年2月25日，星期天第80页,共105页，2024年2月25日，星期天3、融合蛋白的纯化收集菌体重悬于裂解液，超声裂菌，离心取上清加入4mL谷胱甘肽树脂颗粒4℃,230r/min结合3h离心去上清，加入PBS混匀，离心去上清洗涤5次沉淀中加入GST660μL4℃,230r/min,10min离心，上清即为纯化蛋白裂解液：PBS,PMSF:5mg/mL，DTT:5mg/mL,Tween20:10mg/mL，溶菌酶:10mg/mL第81页,共105页，2024年2月25日，星期天第82页,共105页，2024年2月25日，星期天Astrategyforhigh-levelexpressionofsolubleandfunctionalhumaninterferonaasaGST-fusionproteininE.coliConstructionofrecombinantpGEX-hIFNa2bexpressionvectorhINFa2bcDNAwasclonedbyanRT–PCRapproachusingmRNApreparedfromhealthyindividualleukocytesexposedinvitrototheNewcastlediseasevirusThecDNAcorrespondingtotheIFNa2bpublishedsequencewasamplifiedusingaforwardprimerthatintroducedanEcoRIsiteatthe5’endofthegene(5’-TGGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3’)andareverseprimercontainingtheXhoIsiteatthe30endofthegene(5’-CGCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3’)purifiedPCRproductdigestedwithEcoRIandXhoIrestrictionenzymesinsertedintotheplasmidpGEX4T1第83页,共105页，2024年2月25日，星期天ScreeningofpGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmidscontainingthecDNAsequenceencodinghIFNa2bwasperformedbyarestrictionmappinganalysisusingBglIIrestrictionthenucleotidesequenceoftheselectedcloneswascheckedbyautomatedDNASequencingAnalysisusingthe‘ABI-PRISM377’DNAsequencer第84页,共105页，2024年2月25日，星期天ConstructionofrecombinantpGEX-D-hIFNa2bexpressionvectorThepGEX-hIFNa2bexpressionvectorwasusedastheDNAtemplateforsite-directedmutagenesis∆F(TGTGATCTGCCTCAAACCCAC)∆R(GGAGCCACGCGGAACCAG)screeningofpGEX-D-hIFNa2bmutantclonesbyrestrictionanalysisusingEcoRIrestrictionenzyme第85页,共105页，2024年2月25日，星期天AnalyticalexpressionofrecombinantGST-rhIFNa2bTheOrigamiBandBL21E.colicelllinesweretransformedwiththewild-typepGEX-rhIFNa2bplasmidandtheGST–IFNjunctionre-engineeredpGEX-D-hIFNa2bplasmid,usingtheTSSmethodfollowingstandardprotocols.Starterculturesof5mlLuria–Bertani(LB)mediumcontaining100mg/mlampicillinwereinoculated,eachwithasingleE.coliOrigamiBorBL21recombinantclone37℃，250r/min,overnightOnemilliliteroftheovernightculturewasaddedto100mlLBmediumsupplementedwith100mg/mlampicillin37℃,OD6000.5第86页,共105页，2024年2月25日，星期天Monitoringofgrowthconditions(temperatureandIPTGconcentration)usingE.coliBL21andOrigamiBstrainseachhoststrainculturewasinducedwiththreeIPTGconcentrations(0.1,0.5and1mM)atanOD600of0.525℃and37℃OD600=2Tochecktheeffectsoftheinducer(IPTG)concentrationandculturegrowthtemperatureontheexpressionofsolubleGST-hIFNa2bwild-typeandGST-D-hIFNa2bmutantrecombinantproteins第87页,共105页，2024年2月25日，星期天AnalysisoftherecombinantGST-rhIFNa2bexpressedintheE.coliBL21straingrown37℃.Bothintracellularsoluble(A)andinsoluble(B)proteinfractionswereloadedonSDS–PAGEgels,andproteinswerestainedwithCoomassieBrilliantBlueR250.LaneMshowsthemolecularweightstandards(RPN756MW)indicatedinkiloDaltons.Lanes1and3correspondtotheproteinsamplescollectedfromanun-inducedcultureofE.coliBL21transformedwithpGEX4T-1andE.coliBL21transformedwiththepGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmid,respectively.Thoselinesserveasacontrolofproteinexpressioninnon-inducedcondition.Lane2correspondstotheproteinsamplecollectedfroma1mMIPTG-inducedcultureofE.coliBL21transformedwithpGEX4T-1.ThislaneservesasacontrolofGSTparentalproteinexpression.Lanes4–6correspondtotheproteinscollectedfromculturesofE.coliBL21transformedwiththepGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmidinduced,respectively,with1,0.5and0.1mMIPTG.solubleinclusionbodiesfractions第88页,共105页，2024年2月25日，星期天ThepresenceofGST-hIFNa2bfusionproteininboththesolubleandinclusionbodyfractionswasconfirmedbywesternblotanalysisusingtheanti-GSTantibody(Fig.3A).However,thesignalfromthesolublefractionwasmuchweakerasassessedbyanalysisofthewesternblotfilmusingtheImageJsoftware.Weobservedanexpressionratioof67.39%insoluble(presentininclusionbodies)andover32.61%soluble(presentinthesolublefraction)GST-hIFNa2bfusionprotein(Fig.3B).第89页,共105页，2024年2月25日，星期天EnhancementofthelevelofsolubleGST-hIFNa2bexpressedinBL21strainatreducedtemperature第90页,共105页，2024年2月25日，星期天ExtractionofGST-hIFNa2brecombinantproteinInducedandun-inducedcellwereharvestedbycentrifugation4000g,30min,4℃WashedwithbufferA4000g,30minProteinextractionwasperformedbyresuspendingthecellpelletinonefifthoftheoriginalculturevolumeofbufferBThecellsweredisturbedbysix30-ssonicationsteps4℃for30minat13500rpm第91页,共105页，2024年2月25日，星期天cellpelletscorrespondingtoinsolubleproteinfractions(suchasinclusionbodies)werewashedseparatelywiththesamevolumeofbufferB.BufferA:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.3BufferB:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.3and1%TritonX-100)第92页,共105页，2024年2月25日，星期天RecombinantproteinexpressionanalysisAnalyzetheintracellularexpressionofGST-D-hIFNa2brecombinantfusionproteininE.colihostcells,bySDS–PAGEElectrophoresis,using15%SDS-polyacrylamidegels.Therecombinantfusionproteinwasdetectedbywesternblot-ECLAssaysTheImageJsoftwarewasusedtocomparefusionproteinexpressionunderdifferentgrowthconditionsTheconcentrationofGST-D-hIFNa2binOrigamiBlysateversusrhIFNa2bobtainedafterthrombincleavageandthetwo-steppurificationwasalsodeterminedbyaquantitativein-housedevelopedELISAassay.ThepurityoftherecombinanthIFNa2bwascheckedbyanalysisof5-mgrecombinantproteinonCoomassieBlueandsilver-stainedSDS–PAGE15%gels.第93页,共105页，2024年2月25日，星期天AffinitychromatographystepandthrombincleavageofGST-hIFNa2brecombinantproteinThesupernatantcontainingthesolubleGST-hIFNa2brecombinantproteinwasloadedonaGSTrapFFaffinitycolumnpre-equilibratedwithbufferA,

1ml/minTheboundmaterialwaswashedwithbufferAuntiltheabsorbanceatanODof280nmreturnedtobaselineGST-D-hIFNa2brecombinantproteinwascarriedoutusingsixcolumnvolumesofelutionbuffer(0.5ml/min)第94页,共105页，2024年2月25日，星期天TheelutedfractionscontainingtheGST-hIFNa2brecombinantproteinwerepooled.ThepurificationstagesandaffinitychromatographicprofileswereanalyzedbyCoomassieBlue-stainedSDS–PAGEgelsandbywesternblotanalysisasdescribedearlierTwentyunitsofthrombinsolutionwereaddedto100μgofelutedfusionproteinandincubatedatroomtemperature(+22℃)for20h.BufferA:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.3Elutionbuffer:50mMTris–HCl,10mMreducedglutathione,pH8.0第95页,共105页，2024年2月25日，星期天Fivethrombinconcentrations,10,20,50,100and200U,wereusedtocleave100mgofaffinity-purifiedGST-IFNa2bfusionprotein.ThecleavageoftheGST-hIFNa2bsamplesusingthefivethrombinconcentrationconditionswasanalyzedonSDS–PAGEfollowedbyawesternblotanalysisusinganti-hINFapolyclonalantibody.Thecleavageratewasnotcompleteanddidnotsignificantlyincreasewhenthrombinconcentrationwasincreased.Identicalresultsofincompletecleavagewereobservedusingdifferentsourcesofthrombin(i.e.differentmanufacturers).第96页,共105页，2024年2月25日，星期天EngineeringoftheGST-hIFNa2bexpressioncassetteToenhancetheamountofthesolubleGST-hIFNa2bproteinexpressionandimprovethrombincleavagerate,wehaveengineeredthesequencecodingfortheGST–IFNjunctionthatincludesthethrombincuttingsite.Thisengineeringconsistedofdeletingthethreeextraresidues(Pro,GluandPhe)atpositions-1,-2and-3fromthefirstamino-terminalresidueofhIFN,andonoptimizingt