转基因育种技术

关于转基因育种技术第一节转基因育种的概念一、植物遗传转化（植物基因工程）

以植物为对象，采用重组DNA技术，将外源目的基因导入受体植物基因组，最后获得外源目的基因正确表达和稳定遗传的新植物类型。

核心技术是重组DNA技术

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重组DNA（recombinantDNA）：是指人工创造的自然界中不存在的DNA分子。主要指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子。

其过程包括如下几个步骤：

从细胞或组织获得DNA并纯化用限制酶切割DNA将获得的限制片段连接到载体上，外源DNA片段与载体连接后形成的杂种DNA分子称为重组DNA分子重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内重组DNA分子复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子，称为克隆克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发第3页,共90页，2024年2月25日，星期天二、转基因育种将植物遗传转化和常规育种技术相结合，培育具有特定目标性状的植物新品种。

第4页,共90页，2024年2月25日，星期天转基因育种技术的一般实验流程目的基因的克隆与鉴定转化载体的构建E.Coli转化，质粒抽提与鉴定农杆菌的转化与活化外植体制备浸染选择培养共培养移栽继代繁殖分子检测生理检测纯化第5页,共90页，2024年2月25日，星期天转基因技术与传统技术的关系

二者本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。

在基因转移的范围和效率上有两点重要区别：第一，传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制。

第6页,共90页，2024年2月25日，星期天第二，传统技术是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后代的表现预见性较差。

转基因技术转移的是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期，因此，转基因技术是对传统技术的发展和补充。第7页,共90页，2024年2月25日，星期天将两者紧密结合，可相得益彰，提高作物品种遗传改良的效率。

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第二节目的基因的获得

根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆；从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。

根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆主要步骤如下：利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子效率低未知基因及产物分离蛋白质明确氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成第9页,共90页，2024年2月25日，星期天第三节植物遗传转化的受体系统受体:是指用于接受外源DNA的转化材料。受体系统:是指用于基因转化的外植体通过细胞或其

他组织培养途径，能高效、稳定地再生无性

系，并能接受外源DNA整合、转化选择对抗

生素敏感的再生系统。转化的主要目的:外源DNA稳定地插入植物细胞的染

色体组中，并再生出完整的植株。

第10页,共90页，2024年2月25日，星期天11良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1、必须具有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体。高

效稳定的再生能力；2、受体材料要有较高的遗传稳定性；3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；4、对筛选剂敏感；5、能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源

基因稳定地插入植物染色体组,转化率高第11页,共90页，2024年2月25日，星期天12常用的受体材料有以下几大类型:1.愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统第12页,共90页，2024年2月25日，星期天132.直接分化再生系统

外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。

现已建立了一些植物幼芽、胚轴、茎尖分生组织等外植体诱导形成直接分化芽再生体系。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。第13页,共90页，2024年2月25日，星期天3.原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得

基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合

体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。第14页,共90页，2024年2月25日，星期天154.胚状体再生系统是指经体细胞培养形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，又称体细胞胚。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力

强，嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。第15页,共90页，2024年2月25日，星期天5.生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。第16页,共90页，2024年2月25日，星期天优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传

物质的能力强，导入外源基因成功率高，更易

获得转基因植株。又因生殖细胞是单细胞，转

化的基因五显隐性影响，外源目的基因充分表

达。因此利用生殖细胞作为转基因受体与单倍

体育种技术相结合，可简化和缩短育种纯化过

程。缺点：获得单细胞只能在开花期，常受到季节及生长

条件的限制。第17页,共90页，2024年2月25日，星期天

第四节植物遗传转化的载体系统一、载体的概念

载体（vector）:将外源基因送入受体细胞的工具

本质是一段DNA分子,是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接，并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。二、载体的功能

作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能：

一是它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上

二是它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。第18页,共90页，2024年2月25日，星期天四、植物基因工程常用载体质粒(plasmid)；病毒载体(virusvector)；噬菌体(phage)；酵母载体(yeastvector)；以病毒载体和质粒载体介导的遗传转化比较多。

第19页,共90页，2024年2月25日，星期天五、Ti质粒有一种土壤细菌,称为农杆菌，它能诱导植物伤口形成冠瘿瘤，细菌的致瘤能力来源于细菌内的一个额外染色体即质粒(plasmid)，称Ti质粒。还有一种细菌称发根农杆菌,决定毛根症的质粒为Ri质粒，即诱发寄主植物产生毛根

.Ti和Ri质粒是理想的基因克隆载体，通过它们可以将外源的DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。第20页,共90页，2024年2月25日，星期天Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有150-200kb大小。在病原菌致病过程中，其中的一段DNA分子（T-DNA）能够插入到植物基因组中并能够稳定表达。

第21页,共90页，2024年2月25日，星期天根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型胭脂碱型农杆碱型农杆菌素碱型（或称琥珀碱型）第22页,共90页，2024年2月25日，星期天不同类型的Ti质粒都具有:（1）T－DNA区（transferred-DNAregions）：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulenceregion）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。第23页,共90页，2024年2月25日，星期天（3）Con区（regionsencodingconjugations）：该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始。第24页,共90页，2024年2月25日，星期天第五节基因转导方法

将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法第25页,共90页，2024年2月25日，星期天

遗传转化分为两种：一种是生物载体介导的遗传转化；一种是非生物载体介导的遗传转化。就非载体转化而言，该系统又可以分为两种类型：种质转化系统和直接转化系统。种质转化系统：以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉粒通道法。直接转化系统：不用任何载体，采用物理化学方法直接将外源基因导入受体细胞，如基因枪法、脂质体法、超声波法等。第26页,共90页，2024年2月25日，星期天1、农杆菌介导的基因转移（1）农杆菌转化的寄主范围

根癌农杆菌和发根农杆菌的寄主范围很广，目前已知有90多科、600余种植物可以感染。如烟草、大豆、棉花、马铃薯、油菜、花生、番茄、苹果、杨树等用农杆菌转化都先后获得成功。遗憾的是大部分单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子。为了克服根癌农杆菌转化单子叶植物的障碍，许多研究者对感染的合适部位和转化方法进行了探讨，并发现乙酰丁香酮和其它酚类化合物可促进大麦、小麦等很多单子叶植物的转化。经过不懈努力，科学家用农杆菌转化重要的单子叶植物如水稻、玉米、小麦等都取得了成功。一、载体介导的转化方法根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的转基因方法。第一批表达外源基因的转基因植物就是用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的200多种转基因植物中，80%以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法产生的。第27页,共90页，2024年2月25日，星期天农杆菌转化首先要求植物外植体能够产生乙酰丁香酮或其它能够诱导Vir区基因的活性物质。

其次是农杆菌能够接近具有再生能力的感受态细胞。（2）农杆菌转化的方法第28页,共90页，2024年2月25日，星期天

可用于农杆菌转化的外植体种类很多，从单细胞（通常是原生质体）、悬浮培养细胞和愈伤组织（未分化的胚性细胞）、薄壁细胞层、组织切片（如萝卜韧皮部和马铃薯块茎薄壁组织）到各种植物器官，如叶、根、茎和花组织的切段等。

第29页,共90页，2024年2月25日，星期天基因转移技术的一般操作

以根瘤农杆菌转化双子叶植物叶片为例1.将表面消毒的叶片切成小块2.小块在过夜培养并稀释到一定浓度的根癌农杆菌液中浸泡几分钟，以便让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。3.从菌液中捞出小块，培养基中培养2天。4.在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养，转化的细胞分化出芽。5.将芽转入含有抗生素的生根培养基上，诱导生根。6.将完整的转基因植株移栽到土壤中。第30页,共90页，2024年2月25日，星期天该方法是Marton等1979年以原生质体为受体建立起来的，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。

A.原生质体共培养法取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。第31页,共90页，2024年2月25日，星期天①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05／ml、农杆菌l07／ml，20℃下保温32小时。③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／L万古霉素，200mg／L羧苄青霉素，200mg／L链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。④3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。

烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为：第32页,共90页，2024年2月25日，星期天B.叶盘共培养法

图该方法最早由Horsch(1985)首创，并已被成功地用于烟草、番茄、矮牵牛和杨树等植物的转化。其步骤是用打孔器取得叶圆片（直径2-5毫米），在过夜培养并调整到合适浓度的农杆菌菌液中浸泡4-5分钟，置于培养基上共培养2～3天，在转移到含有选择剂的培养基上，使转化细胞直接再生植株。叶圆片法经过改良可以用于茎段、叶柄和萌发种子等其它外植体的转化。优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。第33页,共90页，2024年2月25日，星期天

把转化外植体，如茎段、幼胚、悬浮培养细胞等农杆菌在一起培养24～48h，用无菌水冲洗数次，洗去农杆菌，将材料转入含有抑菌剂（如cefotaxime等）的培养基中培养，选择转化体。C.共培养法原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。第34页,共90页，2024年2月25日，星期天又称整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。D.直接接种法优点：方法简便，实验周期短，因培养基不与农杆菌直接接触，故污染较少。第35页,共90页，2024年2月25日，星期天二、DNA直接导入的基因转化技术

DNA直接导入的基因转化技术：是指不依赖农杆菌载体和其它生物媒体，将外源目的基因直接导入植物细胞，实现基因转化的技术，又称为无载体介导转化。这为不易通过农杆菌等载体介导转化的植物提供了外源基因导入的有效途径。根据DNA导入机理可分为：化学法：是以原生质体为受体，借助特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。目前主要有PEG法和脂质体法。物理法：是基于许多物理因素对细胞膜的影响或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。原生质体、细胞、组织及器官均可作为外植体，比化学法更具广泛性和实用性。常用的方法有基因枪法、超声波法、电击法等。

第36页,共90页，2024年2月25日，星期天1、物理方法（1）基因枪法

80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。

第37页,共90页，2024年2月25日，星期天操作技术程序为：基因枪示意图首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。

第38页,共90页，2024年2月25日，星期天基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。基因枪法的特点：（1）转化效率高。（2）受体广泛。（3）操作简单。第39页,共90页，2024年2月25日，星期天基因枪法缺点与农杆菌介导法比，转化效率低形成的嵌合体多结果的重复性差遗传稳定性差仪器昂贵成本高若与农杆菌法结合，可提高转化效率第40页,共90页，2024年2月25日，星期天（2）电激法(electroperation)又称电穿孔发，是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。

原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿，形成短暂性可逆性的开闭通道，外源DNA进入细胞。

电转仪第41页,共90页，2024年2月25日，星期天（3）微注射法（micro-injection）

微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。

真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。

第42页,共90页，2024年2月25日，星期天

直接注射法：是用注射针直接将大量的DNA注入植物组织或器官达到转化的目的，如子房、分蘖节、幼穗等，又称宏量注射法。

在注射过程中，针尖往往摧毁了被注射的细胞，因此该法试图利用与被注射细胞邻近的组织细胞吸收外源DNA。第43页,共90页，2024年2月25日，星期天（4）激光微束法(lasermicrobeam)（5）超声波法

此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。

利用超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活，是一种有潜力的转化途径。（6）离子束法

离了束作用在生物表面后可引起电子溅射，离子束的溅射好象一把手术刀，对生物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原来不连通的通道在一定距离内连通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上。

第44页,共90页，2024年2月25日，星期天（7）碳化硅纤维介导DNA转移法是简单、快速、经济的导入DNA进入植物完整细胞的方法。应用直径为0.6微米、长度为10-80微米的碳化硅纤维，使附着于纤维或细胞壁上的DNA，借助与在漩涡震荡引起的相互碰撞过程中纤维对细胞的穿刺作用进入细胞，实现转化。（8）DNA卵育法（又称浸泡法）利用供体DNA溶液与受体的种子、幼胚、幼穗、及幼苗等器官的接触，使外源DNA进入受体细胞内，然后与受体细胞基因组重组，产生转化效果。方法：浸种、浸苗、浸胚、浸芽特点：简单、快速、方便第45页,共90页，2024年2月25日，星期天2．化学方法

（1）PEG法

是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连，即具有细胞粘合作用；PEG还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，因而能促进原生质体融合和改变细胞膜的通透性，从而有利于外源DNA进入原生质体，实现基因遗传转化。第46页,共90页，2024年2月25日，星期天

脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，可将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。(2)脂质体法第47页,共90页，2024年2月25日，星期天3.花粉管通道法（pollen-tubepathwaysystem）

原理是授粉后使外源DNA能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法转化实质是受精过程转化。花粉粒在柱头上萌发形成花粉管，不断向胚囊伸长，滴注在柱头上的外源DNA随着花粉管进入胚囊。花粉管通道法是由周光宇等(1978)建立并在长期科学研究中发展起来的。第48页,共90页，2024年2月25日，星期天通过花粉管通道常用的外源基因导入方法A.柱头滴注法

将外源DNA溶液直接滴于授粉后2-3小时的柱头上，或将授粉后柱头切除一部分，在切除处花粉管孔处滴加外源DNA。B.花粉粒与外源DNA混合授粉法

将DNA溶液与适量新鲜花粉迅速混合成糊状，立即涂在柱头上，套袋隔离至种子成熟。或将DNA溶液涂在柱头上，然后立即将采集的花粉洒落在柱头上。C.花粉粒培养法

取新鲜的花粉洒落在柱头上，待萌发时取下加入外源DNA溶液中混均后在涂在柱头上。D.花粉粒转化法

又称花粉携带发，先用农杆菌、基因枪、微注射等方法将外源DNA导入花粉粒，涂在柱头上。第49页,共90页，2024年2月25日，星期天50第六节转化植株的检测与鉴定外源目的基因转化频率低

如何选择和筛选转化体是一个重要问题。第50页,共90页，2024年2月25日，星期天一、选择标记基因外源目的基因转化频率低，目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少，使用特异性选择标记基因（selectablemarkergenes）进行标记，有效地选择出真正转化细胞。表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因第51页,共90页，2024年2月25日，星期天原理：选择标记基因的主要功能是该基因的产物给予植物细胞一种选择压力，致使未转化细胞在施用选择剂条件下不能生长、发育与分化，而转化细胞对该选择剂产生抗性，不影响其生长、发育，从而将转化细胞及植株选择出来。第52页,共90页，2024年2月25日，星期天必须具备以下四个条件：①编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；②基因较小，可构成嵌合基因；③能在转化体中得到充分表达；④检测容易，并且能定量分析。第53页,共90页，2024年2月25日，星期天54常用选择标记基因：

编码抗生素的抗性基因编码除草剂的抗性基因将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。第54页,共90页，2024年2月25日，星期天常用选择标记基因：

编码抗生素的抗性基因:新霉素磷酸转移酶基因II（nptII），编码新霉素磷酸转移酶II（nptII），抗代谢物（选择剂）为卡那霉素（Kanr）、新霉素（Neor）、氨基葡萄糖苷（Aphr）。

编码除草剂的抗性基因：PPT乙酰转移酶基因（Pat），又称bar基因，编码PPT乙酰转移酶，抗草丁膦、双丙氨膦。

第55页,共90页，2024年2月25日，星期天

常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。第56页,共90页，2024年2月25日，星期天二、报告基因：

植物基因工程中，常采用另一类标记基因来检测转化的目的基因是否在受体植物细胞组织中得到表达，给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。理想的植物报告基因应具备以下特征：A.编码的产物是唯一的，并对宿主植物细胞无毒性B.表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞

内不存在C.产物表达水平稳定D.便于检测第57页,共90页，2024年2月25日，星期天

冠瘿碱基因（nos、ocs）Gus基因(β-葡糖苷酸酶基因)Cat(氯霉素乙酰转移酶基因)(GFP)绿色荧光蛋白基因第58页,共90页，2024年2月25日，星期天报告基因:

Gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因）Gus基因是一种报告基因。报告基因系指其编码产物能够被快速测定的一类基因，常用来检测转基因的瞬间表达。

Gus基因来源于细菌，其功能是编码β–葡萄糖苷酸酶(β–glucuronidase，GUS)，该酶能催化许多β–葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，因而Gus基因被广泛用作转基因植物的报告基因。用于GUS检测的常用底物有三种：5–溴–4–氯–3–吲哚–β–D葡萄糖苷酸酯(X–Gluc)4–甲基伞形酮酰–β–D–葡萄糖醛酸苷酯(4–MUG)

对硝基苯β–D–葡萄糖醛酸苷(PNPG)

第59页,共90页，2024年2月25日，星期天β–葡萄糖苷酸酶(GUS)检测上具有以下特点：①GUS与X-Gluc底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。②当加入4–MUG及PNPG，发黄色荧光，用荧光光谱法测定（λ=465nm）。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。第60页,共90页，2024年2月25日，星期天β–葡萄糖苷酸酶(GUS)检测上具有以下特点：③检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。④价格便宜。第61页,共90页，2024年2月25日，星期天GFP（绿色荧光蛋白基因）

LUC（萤火虫荧光素酶基因）报告基因:第62页,共90页，2024年2月25日，星期天三.外源基因整合的分子检测PCR检测利用PCR扩增检测外源基因整合时，要以被检组织DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。非转化植株基因组DNA中不含有外源基因，则无特异性扩增条带出现。

注意：PCR扩增可以扩增选择标记基因，也可扩增目的基因。标记基因的存在并不能完全代表目的基因的存在第63页,共90页，2024年2月25日，星期天

◆PCR反应包括三个步骤：

●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。

●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃

●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链

◆

这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是体外快速扩增DNA的方法第64页,共90页，2024年2月25日，星期天

PCR产物可以通过电泳检测琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第65页,共90页，2024年2月25日，星期天66特异性PCR检测外源基因整合到受体第66页,共90页，2024年2月25日，星期天转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株）第67页,共90页，2024年2月25日，星期天Southern杂交Northern杂交细胞原位杂交常用的转基因生物分子检测手段有四、核酸分子杂交技术检测转基因第68页,共90页，2024年2月25日，星期天转基因植物鉴定所涉及的核酸分子杂交有:Southern杂交是以已知DNA或RNA为探针，检测目标DNA的存在，用于外源目的基因整合的鉴定及分析。Northern杂交是以已知DNA或RNA为探针，检测特异的mRNA分子的存在，用于外源目的基因转录产物（mRNA）的检测。细胞原位杂交是一项组织化学与分子杂交相结合的技术，用来检测组织细胞内目标DNA或RNA分子存在位置，采用这一技术可以确定整合有外源基因的染色体及外源基因在染色体上的位置。另一类似的技术是Western蛋白质杂交，它是利用抗原与抗体特异结合的原理检测外源目的基因表达产物特异蛋白的生成。第69页,共90页，2024年2月25日，星期天70核酸分子杂交技术核酸分子杂交：是指一条单链核酸分子（DNA或RNA）通过碱基互补与另一条单链核酸分子形成稳定双链的过程。

基本原理：碱基互补、变性和复性

DNA与DNA杂交：A=T、G≡C;DNA与RNA杂交:A=U、G≡C;

变性：

升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链；

复性：

缓慢降低温度（52℃左右），变性的两条单链重新形成

互补双链。

碱基互补:第70页,共90页，2024年2月25日，星期天1.Southern杂交(Southernblotting)◆将DNA用限制性酶酶切→酶切DNA电泳→变性→转移到膜上→经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交→洗去膜上非特异性结合的探针→检测杂交信号。◆如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。

此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。第71页,共90页，2024年2月25日，星期天带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程第72页,共90页，2024年2月25日，星期天73Southern杂交进行基因诊断第73页,共90页，2024年2月25日，星期天M123456789kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-转基因棉花的Southern杂交检测（M为分子量标准，1为阳性对照，2为阴性对照，3-8为转基因植株）第74页,共90页，2024年2月25日，星期天75Southern