遗传与基因工程课件

遺傳與基因工程一、遺傳1、不同研究水準：

個體（研究內容、變異來源）分子（微觀、人為干預DNA）群體（宏觀、進化）雜交在同一物種內進行，轉基因技術則沒有限制。雜交沒有人工的基因植入，轉基因工程人工直接改造DNA，更難以控制一對容易混淆的概念遺傳學之父孟德爾（1822－1884）2、歷史回顧1866年，孟德爾（G.J.Mendel）提出了遺傳因數（hereditaryfactor）的概念。他將控制豌豆性狀的遺傳因素稱之為遺傳因數形成了基因的雛形。1909年，丹麥的遺傳學家W.Johanssen根據希臘語“給予生命”之義，創造了“gene”一詞。但它只是一個抽象的單位，並不代表物質實體。

1910年，美國遺傳學家摩爾根（T.H.M.organ）以果蠅為研究材料，發現了連鎖交換定律並提出遺傳粒子學說，第一次將代表某一特定性狀的基因與某一特定的染色體聯繫起來，即基因位於染色體上。1944年，美國微生物學家O.T.Avery首次證實遺傳物質的基礎是DNA，基因位於DNA上。1953年Watson和Crick揭示了DNA的雙螺旋分子結構

1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操縱元（操縱子）的概念，揭示了原核生物基因表達調控的重要規律。1972年，重組DNA分子建立，標誌著基因工程誕生。二、基因工程

１、定義

基因工程又叫做基因拼接技術或DNA重組技術。這種技術是在生物體外，通地對DNA分子進行人工剪切和拼接，對生物的基因進行改造和重新組合，然後導入受體細胞內進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生人類所需要的基因產物。通俗地說，就是按照人們的意願，把一種生物的個別基因複製出來，加以修飾改造，然後放到另一種生物的細胞裏，定向地改造生物的遺傳性狀。基因工程基因工程的別名操作環境操作對象操作水準基本過程結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水準人類需要的基因產物剪切→拼接→導入→表達實質基因重組2、生物技術四大支柱基因是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。3、基因DNA的結構原核基因組成真核基因組成4、基因工程簡介基因操作的工具基因工程的技術路線基因操作的工具基因的剪刀——限制性內切酶基因的針線——DNA連接酶基因的運載工具——載體限制性內切酶

限制酶是在生物體(主要是微生物)內的一種酶，能將外來的DNA切斷，由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶。特點：特異性。即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，並且能在特定的切點上切割DNA分子。

寄主控制的限制與修飾現象

寄主控制的限制與修飾現象，簡稱R/M體系，同免疫體系類似，它能夠辨別自己的DNA和外來的DNA，並使後者降解掉。有關寄主控制的限制與修飾現象的分子生物學研究發現，它是由兩種酶活性配合完成的，一種叫修飾的甲基轉移酶，另一種叫核酸內切限制酶。

寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，它的存在有兩方面的作用，一是保護自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。根據限制－修飾現象發現的核酸內切限制酶，現在已成為重組DNA技術學的重要工具酶。

基本特性絕大多數的II型核酸內切限制酶，都能夠識別由4～8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列，這些識別序列又稱核酸內切限制酶的切割位點或靶子序列，它們有一個共同特點：具有雙重旋轉對稱的結構，換言之這些核苷酸對的順序是呈回文結構。

核酸內切限制酶酶切造成的DNA分子的斷裂類型：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片段；兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，形成具有平末端的DNA片段。

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，並在G和A之間切開。限制酶限制酶

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。酶切反應系統：底物DNA

核酸內切限制酶緩衝液（Tris-HCI、Mg)

溫度(37)

基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。

DNA連接酶

1967年，世界上有數個實驗室幾乎同時發現了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。這種酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個游離的羥基和在另一條DNA鏈5’-末端具有一個磷酸基團，而且還需要有一種能源分子的存在才能實現這種連接反應。

值得注意的一點是，DNA連接酶並不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。分類：

大腸桿菌DNA連接酶：（平末端)T4噬菌體DNA連接酶（平末端、黏性末端）

由限制酶產生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應混合物中會發生自我環化作用，並在連接酶的作用下重新變成穩定的共價閉合的環形結構。為了克服這一缺點，一般是用細菌的或小牛腸的鹼性磷酸酶，預先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5’磷酸基團。連接酶反應系統：（類似酶切）

連接酶連接缺口DNA的最佳反應溫度是37℃。但是在這個溫度下，粘性末端之間的氫鍵結合是不穩定的，尤其是對於那些粘性末端配對堿基數少而且多為A-T的限制性片段，因此，連接粘性末端的最佳溫度，應該是界於酶作用速率和末端結合速率之間，一般認為4～15℃比較合適。載體必須具備條件載體1）能夠在宿主細胞中複製並穩定地保存。2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3）具有某些標記基因，便於進行篩選。如抗菌素的抗性基因、產物具有顏色反應的基因等。常用的運載體主要有兩類：

1）細菌細胞質的質粒

2）噬菌體或某些動植物病毒質粒：

質粒是染色體外能夠進行自主複製的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中核區外的DNA分子。現在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質粒是基因工程最常用的運載體。絕大多數細菌質粒都是閉合環狀DNA分子。有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。大腸桿菌的質粒

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒，其中常含有抗藥基因，如四環素的標記基因。質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用，但複製只能在宿主細胞內成。質粒的生物學特性：

1、質粒DNA的構型：

SC型共價閉合環形DNA（cccDNA）

OC型開環DNA（ocDNA）

L型線性DNA（cDNA）

2、不同質粒的分子量大小差異相當顯著：

106~108D

3、作為載體的質粒都含有三種共同的組分：

複製基因（replicator）、選擇性記號、克隆位點

質粒DNA的分離與純化

1、氯化銫密度梯度離心法；

2、堿變性法；

1、氯化銫密度梯度離心法

1、質粒DNA占總DNA的1%～2%；

2、在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷裂成線性片斷，而質粒DNA分子量小，結構緊密仍保持完整的狀態；

3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA複合物中，EB含量越高，密度會越低。2.堿變性法：

根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓撲學上的差異而發展出來的。在PH值12.0～12.5範圍內時，線性的DNA會被變性而共價閉合環狀質粒DNA卻不會被變性。

通過冷卻或恢復中性PH值使之複性，線性染色體形成網狀結構，而cccDNA可以準確迅速複性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最後用乙醇沉澱，獲得質粒DNA質粒載體的構建

天然質粒：沒有經過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質粒。在大腸桿菌中，常見的可用於基因克隆的天然質粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。

pBR322質粒載體“P”表示是一種質粒；“BR”表示兩位主要構建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實驗編號。BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX

pUC質粒載體人們應用多克隆位點技術，在pBR322的基礎上，組入了一個在其5’-端帶有一段多克隆位點的lacZ’基因，而發展的具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。

AmproripUC18(3kb)MCS

(Multiplecloningsites,

多克隆位點）LacpromoterlacZ’

噬菌體載體（Bacteriophage，簡稱phage）

噬菌體的溶源生命週期溶源生長週期：

是指在感染過程中沒有產生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。

λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)

溶菌階段(複製和釋放)

溶源階段

(整合到寄主染色體上)DNAProteincoatcoscosNonessential

regionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpVirusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)體外包裝

λ噬菌體DNA體外重組後，一般必須經過體外包裝，然後以噬菌體感染的方式將重組DNA導入E.coli細胞內。

λ噬菌體的包裝限制為野生噬菌體DNA（約48.5kb）的75%~105%。根據噬菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選其他載體

柯斯質粒載體

YAC克隆載體柯斯質粒載體cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用於克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質粒的複製起點、克隆位點、選擇性標記以及λ噬菌體用於包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組後，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在於細胞內。柯斯質粒載體的特點具有質粒載體的特性；具有λ噬菌體的特性；具有較高容量的克隆能力；YAC載體：人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應運而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(centromere)及複製起點等功能序列，可插入長度達200-500kb的外源DNA，導入酵母細胞可以隨細胞分裂週期複製繁殖供作克隆，成為人基因組研究計畫的重要基因操作的基本步驟1）提取目的基因2）目的基因與運載體結合3）將目的基因導入受體細胞4）重組子的篩選和表達步驟1、提取目的基因

目的基因是人們所需要轉移或改造的基因。

如蘇雲金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。一定是結構基因？目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉錄法（cDNA文庫)根據已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法（基因組文庫）鳥槍法（gunshot散彈射擊法）：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量複製（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再利用一定發方法將目的基因的DNA片段分離出來。反轉錄法：以目的基因轉錄成的信使RNA為範本，反轉錄成互補的單鏈DNA，然後在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成cDNA克隆的優越性cDNA克隆以mRNA為材料，這對於有些RNA病毒來說是特別適用的；cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行；由於每個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在選擇中出現假陽性的幾率比較低；根據已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然後按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成三種目的基因提取的方法優缺點優點缺點鳥槍法反轉錄法根據已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時並非一個基因專一性強操作過程麻煩，mRNA很不穩定，要求的技術條件較高專一性最強僅限於合成核苷酸對較少的簡單基因步驟2：目的基因與運載體重組1）用一定的限制酶切割質粒，使其出現一個切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。常用的受體細胞（優缺點）

微生物、動物、植物細胞等。常用導入方法：步驟3：目的基因導入受體細胞

微生物（轉化）

1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。（感受態細胞）

2）使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。

3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而複製，由於細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因。動物細胞轉導轉染顯微注射植物細胞農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法基因槍法花粉管通道法

Ti質粒可分為4個區：⑴T-DNA區。T-DNA是農桿菌感染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，稱為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關；⑵Vir區，該區段上的基因能啟動T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，稱為毒性區；⑶Con區，該區段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因，調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移，稱為接合轉移區；⑷Ori區，該區段基因調控質粒的自我複製，稱為複製起始區。步驟4：重組子的筛选載體遺傳表型直接篩選法（雙抗、藍白斑）雙酶切法（電泳）核酸分子雜交檢測法（三種）DNA序列測定法(Sanger測序）基因表達產物分析法（Pro、生化方法）

不能，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子後就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。真核基因與原核表達系統不同表達不同（轉錄、翻譯）5、基因工程的主要技術及原理離心電泳PCR擴增分子雜交DNA測序離心低速離心機高速離心機（低溫）核酸的凝膠電泳基本原理

帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應活性的穩定的介質（瓊脂糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負極移向正極。根據核酸分子大小不同、構型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。

用已知分子量的標準DNA對DNA片斷大小的估算

凝膠電泳的分辨力：

與凝膠的類型和密度相關瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間;

聚丙烯醯胺的分辨力在1～1000bp之間電泳的遷移率取決於核酸分子本身的大小和構型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構型的核酸分子，構型緊密的比鬆散型的開環DNA分子或線性DNA分子遷移率要快

PCR技術

聚合酶鏈式反應

PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應示意圖(e)(f)(g)溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）迴圈1迴圈2迴圈3PCR反應的溫度迴圈週期PCR反應的每一個溫度迴圈週期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復始，重複進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。核酸分子雜交技術原理：帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區段將會退火形成雙鏈的結構。

（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉移雜交技術Northern雜交不同之處（Southern)

雜交對象電泳條件菌落雜交

也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘乾後，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。鑒定重組子。檢測重組體克隆的菌落雜交技術DNA核苷酸序列分析Sanger雙去氧鏈終止法原理：雙去氧鏈終止法要求使用一種單鏈的DNA範本和一種適當的DNA合成引物。利用DNA聚合酶的兩種酶催化反應的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA為範本，合成出準確的DNA互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2’，3’-雙去氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的延長。

DNA測序分析的自動化用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作螢光劑，預先標記M13引物DNA5’-末端，按標準的雙去氧鏈終止法同引物進行反應，用聚丙烯醯胺電泳分析。在電泳過程中，用鐳射激發電泳的片斷產生螢光，被螢光感受器接受，最終轉換成電信號，被電腦讀出，或列印出來6、基因工程的應用人類健康（69%）植物(13%)動物（８％）食品（５％）環境、能源（４％）基因工程藥物美國批准上市的基因工程藥品有人類胰島素、人類生長因數、白介素、干擾素、牛型生長激素疫苗等。我國自1986年“863”計畫實施以來，至1998年已有14種基因工程藥物，3個基因工程疫苗和數十個重組診斷試劑投放市場。基因治療：指利用遺傳學的原理治療人類的疾病。目前人類基因治療主要集中在遺傳性疾病、腫瘤及某些傳染性疾病。至1997年初，全世界共記錄了2103例基因治療病例（美國1700例）。其中6