口岸松材线虫疫情监测技术规范

3口岸松材线虫疫情监测技术规范本文件规定了口岸松材线虫疫情监测方法和技术，明确了监测抽样、实验室检测以及疫情管理等要本文件适用于口岸进出境松木及其制品、木质包装材料、松材线虫寄主繁殖材料以及监管场所诱捕的媒介天牛是否携带松材线虫的疫情监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T23476松材线虫病检疫技术规程GB/T23478松材线虫普查监测技术规程GB/T35342松材线虫分子检测鉴定技术规程SN/T1132松材线虫检疫鉴定方法SN/T1724进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程SN/T4350旅客携带物和邮寄物检疫鉴定和处理程序3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1松材线虫pinewoodnematode学名：Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle。一种植物寄生线虫，属于线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、滑刃目（Aphelenchida）、滑刃总科（Aphelenchoidoidea）、滑刃科（Aphelenchoididae）、伞真滑刃亚科（Bursaphelenchinae）、伞滑刃线虫属（Bursaphelenchus能引起松树萎蔫病，是针叶树木上最重要的病原生物之一。3.2媒介天牛vectorbeetle在自然条件下，松材线虫需依靠墨天牛属（Monochamus）的天牛实现远距离传播，可传播松材线虫的天牛称之为媒介天牛。3.3松墨天牛MonochamusalternatusHope,1843又名松褐天牛、松天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus是为害松树的一种蛀干性昆虫，为传播松材线虫的主要媒介天牛。43.4木材wood带皮或不带皮的原木、锯木、木板、木片等。3.5原木rawwoods未经过干燥、化学防腐剂等处理，并未永久改变其特性的木材。3.6松木及其制品pinewoodandwoodenware指松科木材和由松科木材为原料制作的产品，包括松木木质包装材料。经人工合成或经加热、加压等深度加工的木质材料（如胶合板、纤维板等）除外。3.7木质包装材料woodpackingmaterials用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、木条箱、木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木、衬木等。3.8疫木diseasedwood感染松材线虫病的寄主植物及其制品，主要为松属（Pinus）植物及其制品。3.9蓝变blue-stain由于松材线虫为害常伴有蓝变菌（或青变菌）的存在而导致木材变为蓝灰色，是判断松材线虫监测抽样的一个辅助而非必要依据。3.10海关监管作业场所customssupervisionworkplace是指由企业负责经营管理，供进出境运输工具或者境内承运海关监管货物的运输工具进出、停靠，从事海关监管货物的进出、装卸、储存、集拼、暂时存放等有关经营活动，符合《海关监管作业场所设置规范》，办理相关海关手续的场所。3.11集中作业场地customscentralizedoperationsite是指从事海关监管货物的进出、装卸、储存、集拼、暂时存放等有关经营活动，基本符合《海关监管作业场所（场地）设置规范》，有一定环境条件或检验、检疫专业要求，因经营主体、属性等因素不具备“海关监管作业场所”管理条件，办理相关海关手续的作业场地。3.12海关监管作业场所（场地）customssupervisionworkplace(site)5海关监管作业场所（场地）划分为监管作业场所和集中作业场地。监管作业场所包括水路运输类海关监管作业场所、公路运输类海关监管作业场所、航空运输类海关监管作业场所、铁路运输类海关监管作业场所、快递类海关监管作业场所等；集中作业场地包括旅客通关作业场地、邮检作业场地等。3.13海关指定监管场地customsdesignatedsupervisionsite是指符合《海关监管作业场所（场地）的设置规范》，满足动植物疫病疫情防控需要，对特定进境高风险动植物及其产品实施查验、检验、检疫的监管作业场地。3.14海关监管货物cargoundercustomssupervision是指所有进出境货物，包括海关监管时限内的进出口货物，过境货物、转运货物、通运货物，特定减免税货物，以及暂时进出口货物、保税货物和其他尚未办结海关手续的进出境货物。3.15诱捕器监测trapmonitoring利用人工合成引诱剂来捕获松墨天牛，并检查其体内、体表是否携带松材线虫的一种监测方法。3.16松墨天牛引诱剂pinesawyerattractant由萜烯类等特异性植物源成分组成的对松墨天牛成虫具有引诱活性的挥发性化合物，需与松墨天牛诱捕器配合使用。4监测范围及内容4.1监测范围海关监管作业场所（场地）及其周边。根据进境木材、种苗的类别和口岸地理特征设置监测区域，重点在进境木材指定监管场地和进境种苗指定监管场地开展监测。4.2监测内容依据全国海关各口岸松材线虫疫情截获数据，结合本关区业务实际，科学制定监测计划及具体实施方案，确保疫情监测不留死角，对应施监测的植物及其产品开展松材线虫疫情监测，即在海关监管作业场所重点开展松木及其制品是否携带松材线虫的监测；在海关集中作业场地开展进境邮寄物及旅客携带物是否携带松材线虫的监测；在海关监管作业场所（场地）及其周边开展诱捕器监测，对诱捕的媒介天牛是否携带松材线虫实施监测，周边有林地的按照GB/T23478-2009中4.9.2执行。重点关注来自美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、朝鲜、葡萄牙、西班牙、印度尼西亚、南非以及中国台湾、香港等国家或地区的松木及其制品、邮寄物及旅客携带物。应施监测的植物及其产品为：来自国内外疫情发生区的松属、雪松属、冷杉属、云杉属和落叶松属等松材线虫寄主植物的苗木、接穗、插条、盆景等生长繁殖材料；来自国内外疫情发生区的上述植物的木材、枝桠、根桩、木片以及它们的制品；带有松材线虫及其传播媒介昆虫活体的货物、包装材料、铺垫材料、运输工具、邮寄物及旅客携带物。松材线虫的寄主植物范围参见GB/T23476-2009中附录A。5监测方法65.1抽样监测观察木材材质是否干燥，木质部是否有蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。重点抽取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品，若无上述特征时，可随机抽样。针对货物的抽样监测，需结合单证查验，即核实产地、品种、数量、证书等信息否与货物相符合，抽样及采样方法按照SN/T1724-2006中6.2和6.3执行。针对邮寄物及旅客携带物的抽样监测，按照SN/T4350-2015中第5章和第6章内容，对可能携带松材线虫的所有寄主植物及其繁殖材料、松木及其制品进行取样监测，不宜现场取样的可将其整体带回送实验室检测。样品标识信息应完整、清晰，确保可溯源、可追查。5.2诱捕器监测5.2.1诱捕器设置重点在口岸木材及木制品装卸地和木质包装集散点等重要疫情监测区域进行布点，每个诱捕器之间相距50m～100m。5.2.2诱捕时间诱捕时间一般为每年的4月至11月，即松墨天牛成虫羽化初期开始，直至当年成虫羽化完毕为宜。5.2.3诱捕器安装及维护诱捕器应安装在空气流通较好的地方，悬空挂置，诱捕器下端离地面1.5m～2.0m。诱捕器上下两端应用铁丝绑牢并固定，引诱剂使用前应充分摇匀，添加或更换引诱剂，应注意防撒漏、防跌落，以免影响诱捕效果。诱捕器应及时维护，结合查虫定期巡查诱捕器，清洗集虫罐，补充水淹式集虫罐中的清水。风雨过后也要及时检查诱捕器，确保诱捕器处于良好的诱虫状态。定期添加诱剂，每隔10d～15d添加1次，并准确填写相关维护记录。5.2.4媒介天牛的收集每隔3d～5d检查一次，及时收集并清理诱捕器中的媒介天牛，详细记录相关信息并在当日送实验室检测。5.2.5安全事项松墨天牛引诱剂属于易燃品，在运输、储存和使用过程中，应遵守国家有关易燃品安全管理的有关规定和安全使用方法。6实验室检测6.1松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗法或浅盘法或改进型线虫分离器法分离线虫，具体操作按照GB/T23476-2009中附录C执行。分离时室内温度应保持在20℃~30℃之间，或置于恒温培养箱中进行分离，分离时间一般需12h～24h以上。将线虫分离液收集到试管或者烧杯中，通过自然沉淀或者使用离心机处理后进行镜检。媒介天牛样品松材线虫的分离，可将天牛剪碎后直接分离或可采用局部分离线虫的方法分离线虫，7即将天牛的触角端部或胸部腿节取下，捣碎后用漏斗法或浅盘法分离线虫，也可直接浸泡于加水的表面皿或培养皿中，2h后在体视显微镜下直接观察是否有线虫。6.2镜检在体视显微镜下仔细观察线虫分离液中是否有线虫。若发现线虫，用挑针挑取线虫并转移至滴加少量水（30µL～40µL）的载玻片上或用微量移液器吸取线虫至载玻片上，载玻片滴加水的部位在酒精灯火焰上方匀速经过8～10次左右，冷却5s后盖上盖玻片制成临时水玻片，置于显微镜下观察。若分离的线虫均为幼虫或成虫数量极少影响后续鉴定时，需培养至成虫后进行鉴定。6.3半永久标本及永久标本的制作按照SN/T1132-2002中附录C.2相关内容执行。6.4线虫培养按照SN/T1724-2006中附录B执行。6.5松材线虫检测鉴定6.5.1形态学鉴定按照SN/T1132-2002中第8章内容执行。6.5.2分子生物学检测普通PCR检测按照GB/T23476-2009中7.5及附录G相关内容执行。实时荧光PCR检测按照GB/T35342-2017中附录C及5.1相关内容执行。6.6结果判定及复核6.6.1结果判定采用形态学方法鉴定的，其结果判定按照SN/T1132-2002中第9章内容执行。采用分子生物学方法检测的，普通PCR检测结果判定按照按照GB/T23476-2009中附录G.3执行，实时荧光PCR检测判定按照GB/T35342-2017中5.1.5执行。6.6.2结果复核对第一次截获松材线虫的结果，需经过专家复核或相关专业检测实验室复核。其中相关专业检测实验室是指具备相应检测技术能力的实验室，即实验室获得CNAS认可的有效能力范围覆盖松材线虫检测项目。提供复核的材料为具松材线虫雌成虫、雄成虫的线虫分离液、临时玻片、照片或影像材料等。7样品的保存及处理样品应及时分离鉴定，若需要保存，应在4℃条件下保存。如木屑、木片或木条等样品，可放入塑料袋内，扎紧袋口，在袋上扎几个小孔，放入4℃冰箱；木段、圆盘可直接裹上几层湿纱布后放入4℃冰箱保存。若需保存时间较长，样品需经常喷水保湿。样品保存应做好登记工作，保存期不少于2个月。经检测发现含有松材线虫的样品，保存期不少于6个月，以备复查、谈判或仲裁。对不宜保存的