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文档简介
实验三
考马斯亮蓝染色法
测定蛋白质浓度目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassiebrilliantblue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质-染料结合的原理,定量测定蛋白浓度的方法,于1976年由Bradford建立。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。几种测定蛋白质含量的方法考马斯亮蓝染色法的突出优点1、灵敏度高,比Lowry法约高4倍,其最低蛋白质检测量可达1μg。2、测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2min即可完成,其颜色可以在1h内保持稳定,且在5~20min之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。3、干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。考马斯亮蓝染色法的缺点1、由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。2、仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物
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