实时荧光定量pcr检测不同品种芸用菌对柚枝果的诊断价值

实时荧光定量pcr检测不同品种芸用菌对柚枝果的诊断价值

橘子又名红棕色，来自广东省四会和广宁地区。近10年来,由于砂糖橘的价格较好且稳定,果农种植的积极性很高,仅广东省砂糖橘种植面积已超过12万hm2,产量近达130万t。但砂糖橘极易感染黄龙病,严重的阻碍了砂糖橘的生产和发展。黄龙病由限制于韧皮部的难养细菌引起,主要分布于筛管细胞中,该病菌归属于原核生物薄壁菌门α-变型菌纲(Proteobacteriacea)的候选韧皮部杆菌属(CandidatusLiberibacterspp),目前尚未能进行分离培养,根据其16SrDNA片段的核苷酸序列,将该菌分为亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus,Las)、非洲种(CandidatusLiberibacterafricanus,Laf)和美洲种(CandidatusLiberibacteramericanus,Lam),中国仅检测到了亚洲种。黄龙病的诊断,主要根据叶片的“黄梢型”和“斑驳型”症状进行。但砂糖橘黄龙病的症状比较复杂,且受环境条件的影响而变化,因此,找到一种田间容易识别和掌握黄龙病的典型症状对病害的诊断和防控具有重要意义。感染黄龙病的砂糖橘在果实成熟期间会出现“红鼻子果”的现象。“红鼻子果”是指果实果柄周围的果皮呈橙红色,而其他部位不着色,即呈现一端红色另一端绿色的着色不均匀的果实。邱柱石等认为,红鼻子果是黄龙病的典型症状,并提出红鼻子果可以作为田间诊断黄龙病的依据。但红鼻子果与韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacterasiaticus,Las)的相关性,目前国内外尚没有相关报道。另外,砂糖橘果实一旦成熟进入着色期,果实则由绿转成橘黄色,但感染黄龙病的红鼻子果只有果柄附近的果皮变红而其他部位仍保持青绿,并伴有味酸、畸形、果小等症状。果实着色期是果实糖分积累并有大量叶黄素形成,而叶绿素大量减少的过程,果柄是营养成分如蔗糖的运输通道,也是黄龙病菌生长的场所。Schneider曾对来自南非的感染了青果病的甜橙枝梢进行解剖学的研究时推测,由于病原引起了韧皮部组织的坏死,进而导致了叶片生成的有机物质不能转运出去,在质体中转化成淀粉。本研究利用TaqMan探针实时荧光定量PCR对砂糖橘黄龙病菌16SrDNA进行特异性扩增,对砂糖橘红鼻子果与Las的相关性进行研究,并利用扫描电镜技术对柑橘果柄韧皮部做了切片扫描电镜观察,以期寻找导致产生红鼻子果的原因。1材料和方法1.1砂糖橘红完善果的采集2008年12月至2009年9月,采集广东云浮、清远、四会的112个砂糖橘红鼻子果样品,并在挂有红鼻子果的病株上采集22个无症状果实,采集叶片斑驳和黄化的样品数分别为85个和25个。其中每个果实作为一个样品,每5个叶片作为一个样品。1.2方法1.2.1果实体积和表面积计算采集砂糖橘健康果实及红鼻子果,用游标卡尺测定果实冷冻状态下果实横径(D)和纵径(D′),利用修正公式V=0.743D′-0.9269D3.7696(D′<5.8cm),V=0.743D′1.0727D1.775(D′≥5.8cm)计算果实体积,依据球体表面积公式S=∏D2计算果实表面积。将红鼻子果“红鼻子”区域横向切下,游标卡尺从果蒂部位垂直量取切下部位高度H,计算该球冠表面积S′=∏DH,则红鼻子果着色率R=S′/S=H/D。1.2.2总dna提取分别称取0.1g叶片叶中脉、果实果柄与果轴,根据OMEGA公司E.Z.N.A.TM植物试剂盒说明书提取总DNA。取3μLDNA溶液在1%的琼脂糖凝胶上电泳,凝胶成像系统(AlphaImager)观察DNA纯度,其余置-20℃低温冰箱保存备用。1.2.3tccrtagaaag景观和探针的设计探针(5′-FAM-AGACGGGTGAGTAACGCG-3′BHQ1)与引物HLBasf(5′-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3′)和HLBasr(5′-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3′)的设计参照Li等的方法。引物和探针根据Las的16SrDNA(基因库登陆号为L22532)特异扩增片段区间找出柑橘黄龙病菌与所有细菌的稳定性突变点,软件Primer3.0设计柑橘黄龙病菌的特异性探针HLBprobe(探针5′端标记报告荧光基团6-carboyfluorescein(FAM),3′端标记淬灭荧光基团[BlackHoleQuencher(BHQ)-1]和引物HLBasf、HLBasr。MastermixQpk-101(实时荧光PCR试剂盒)购自TaKaRa生物工程有限公司。1.2.4pendorfbiopho有效基因检测重组质粒A3参照Harakava等的方法对Las的16SrDNA进行特异扩增,得到1160bp片段,再用pGEM-载体连接克隆,利用EppendorfBiophotometer核酸蛋白测定仪测定质量的浓度和纯度,测得其原液浓度为8×106fg/μL,-20℃保存备用。以10倍梯度稀释8个梯度做定量标准模板。1.2.5实时荧光pcr检测rotor-gene6反应时间及条件以植物总DNA为模板,实时荧光定量PCR反应体系:Mastermix10μL,asf(10μmol/L)和asr(10μmol/L)各0.4μL,探针(5μmol/L)0.4μL,模板DNA1.0μL,ddH2O7.8μL,总体积为20μL。于Rotor-Gene6实时荧光PCR仪上进行扩增,反应条件:95℃1min,95℃15s,58℃45s,40个循环。反应时间约95min,每轮反应以A3质粒标准品的8个梯度作为外参照,健康柑橘DNA为负对照,ddH2O为参照以及待测DNA样品的3个重复。1.2.6酸氧化合物处理2009年5月份从清远病果园和健康果园分别采集红鼻子果和健康果实各6个,将果柄部位横切成均匀的0.1mm薄片,用2.5%的戊二醛前固定4h,用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次10min;用1%四氧化锇固定1.5h,用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次10min;依次用50%,70%,80%,90%乙醇各漂洗1次,每次10min;用醋酸异戊醇过渡2次,每次20min;然后用二氧化碳临界点干燥,用铂金镀膜,待凝固后,放于型号为XL30-ESEM扫描电子显微镜下观察。2结果与分析2.1染色与果柄“红鼻子果”是指果实果柄周围的果皮呈橙红色,而其他部位不着色,即呈现一端红色另一端绿色的着色不均匀的果实(图1-A),且比正常果显著变小(图1-B),果型歪斜且种子败育(图1-C),果柄呈橙红色(图1-D),果实味酸口感较差。2.2红鼻子果平均体积和数量参照1.2.1方法进行果实体积测定和果皮着色率的计算。结果表明(表1),红鼻子果与健康果体积差异性显著,红鼻子果平均体积为18.6cm3,而健康果实平均体积为44.2cm3,是红鼻子果平均体积的2.4倍。将红鼻子果着色率分为0.0~0.1、0.1~0.2、0.2~0.3、0.3~0.4、>0.4五个等级,五个等级红鼻子果数量分别为9(30%)、13(43.3%)、5(16.7%)、2(6.7%)、1(3.3%),而健康果实为0、0、0、0、30(100%),两者有显著差异。且90%红鼻子果的着色率小于0.3。2.3实时荧光定量pcr检测将A3重组质粒以10倍稀释8个浓度梯度作为标准品,各梯度分别取1μLDNA溶液为反应模板,在特异引物HLBasf/HLBasr和探针HLBprobe的系统中进行实时荧光PCR定量扩增反应。从左向右的反应模板依次为10-1~10-8(图2)。曲线为一组典型的倒S型曲线,由图2可知,模板浓度越高,可检测到荧光信号时对的循环数越少,即循环阈值(Ct)越小,且随着循环数的增加,荧光信号逐渐增强,当循环数达到一定程度时,荧光强度达到平台期不再增长。以起始模板的病原浓度对数为y轴,Ct值为x轴做回归曲线,即得到标准品A3质粒(CandidatusLiberibacterasiaticus)的检测标准曲线(图3),拷贝数与Ct值之间的线性关系:Ct=-3.133×log(conc)+34.042(从软件上直接读出),相关性系数r为0.99872,说明各浓度组间的相关性非常好。在柑橘黄龙病实时荧光定量PCR检测反应中,所克隆的柑橘黄龙病重组质粒A3的DNA浓度为8×106fg/μL,以10倍梯度依次稀释8个梯度后作为标准品,每个梯度取1μL做3次邻孔的重复检测。结果显示,8个核酸浓度梯度各自的检测Ct值变异系数依次为0.12%、0.42%、0.17%、0.25%、0.30%、0.15%、0.10%、0.07%,表明检测方法具有较好的稳定性和重复性,可以对病原菌进行可靠地定量检测。从扩增曲线可见,大约经过30个循环以后,10-1~10-7梯度稀释的7个样品均出现了明显的荧光累积,此时10-7梯度样品对应的扩增循环数为29.98,刚好接近于阈值线对应值30(阈值代表的荧光信号值显著大于背景信号)。而稀释梯度为10-8的样品,在经历30个循环后,仍没有出现明显的扩增荧光信号,所以可以确定实时荧光定量PCR对Las的检测浓度下限为10-7,这时对应的病菌DNA浓度达到检测的最低值,即8fg/μL,此时黄龙病菌检测呈阴性,Las病菌浓度高于8fg/μL的样品均为阳性样品。2.4las的检出为了比较砂糖橘叶片、红鼻子果与无症状果实带菌率及病原浓度,对所有样品进行TaqMan实时荧光定量PCR(表2)。利用SAS进行单因素方差分析,发现红鼻子果、不显症果实及显症叶片Las病原浓度差异极显著。红鼻子果样品Las阳性检出率最高为100.0%,而斑驳和均匀黄化叶片的阳性检出率分别为91.8%和52.0%,不显症果实带菌率达到27.3%,均明显低于红鼻子果阳性检出率。携带病原浓度从大到小的部位依次为红鼻子果(526.6fg/μL)、斑驳叶片(190.3fg/μL)、均匀黄化叶片(25.7fg/μL)、无症状果实(8.4fg/μL),其最高带菌率依次为2604.5、561.0、76.8、34.5fg/μL,病原浓度差别较大。2.5单因素方差分析对24个果实的果柄和果轴总DNA进行实时荧光PCR检测Las浓度。利用SAS软件进行单因素方差分析可知,果柄和果轴病原浓度差异极显著。果柄部位的病原浓度高于果轴的样品为21个,占总数的87.5%。果柄中平均病菌浓度为931.6fg/μL;果轴平均病原浓度为340.6fg/μL。表明果柄可作为电镜观察病原的材料。2.6健康果柄韧皮细胞的形态观察对砂糖橘健康果柄及红鼻子果果柄韧皮部横切面扫描电镜观察可知:健康果柄韧皮部筛管细胞呈圆形且仅可见少量的淀粉粒(图4-A);而病果柄的韧皮部筛管细胞杂乱无章(图4-B),有大量的淀粉粒沉积,堵塞筛管(图4-C)3田间鉴定的结果砂糖橘是广东、广西柑橘种植产业的优势品种,农民脱贫致富的支柱产业,但黄龙病对砂糖橘的产量和品质均造成了严重的影响。目前防控该病害的方法主要是通过种植无病苗木、及时挖除病株、防治传病介体及加强栽培管理等,找到一种快速诊断该病害的方法对病害的防控有重要意义。本研究通过成功构建柑橘黄龙病亚洲种A3重组质粒标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测系统,并通过稳定性、灵敏性和可靠性进行检测,表明该技术完全可以用于CandidatusLiberibacteasiaticus的早期动态检测和病原浓度的分析比较,比常规PCR检测更为灵敏和稳定。利用TaqMan实时荧光定量PCR技术对砂糖橘红鼻子果,斑驳叶片和黄化叶片进行CandidatuLiberibacterasiaticus检测。结果表明,斑驳症状叶片的Las阳性检出率为91.8%,而黄化叶片Las阳性检出率为52.0%。斑驳叶片往往表现在老熟叶片上,而田间柑橘的缺锌状花叶到后期主侧脉处有不规则的绿色带,易与黄龙病相混淆。有些果园由于地势低洼从而积水严重,且失管果园中有些果树是受到黄龙病的为害表现黄化,而有些果树则由于施肥不够及时,同时受其他病虫害的为害等,叶片也表现黄化症状。在这种情况下,容易将其他因素引起的斑驳或黄化病株与黄龙病病株相混淆,造成病株的误判,从而造成不必要的损失。而红鼻子果的Las阳性检出率达到100%,且与斑驳和黄化叶片相比,其病原浓度较高,这对病株的试验检测更为有利。另外,田间观测红鼻子果体积明显变小且从果蒂附近开始着色,通过测定,健康果实是红鼻子果平均体积的2.4倍,且果实的着色率明显低于健康果实,90%病果的着色率小于0.3。红鼻子果的症状明显,且与健康果实容易区分,易被农民识别和掌握,因此可将其作为田间识别黄龙病的典型症状。对于红鼻子果症状出现的原因,国内外尚无详细的研究报道。Schneider曾对来自南非的感染了青果病的甜橙枝梢进行解剖学的研究时推测,可能由病原引起了韧皮部的坏死,进而导致了叶片生成的有机物质不能转运出去,在质体中转化成淀粉。本试验通过对24个红鼻子果果柄和果轴病原浓度的分析可知,果柄病原浓度较高,因此笔者将砂糖橘果柄部位作为电镜扫描的材料,通过扫描发现其韧皮部缢缩,筛管细胞混乱,并有大量的淀粉粒沉积于筛管。柑橘光合作用合成的蔗糖在果实成熟阶段通过韧皮部装载进入筛管运输,运输至果柄处卸出,进入果实维管束,一部分运输至果皮供其利用,一部分进入汁囊进行代谢和积累。果实表皮是柑橘主要的类胡萝卜素库存部位,随着果实的成熟和发育,果皮叶绿素含量不断下