第6章 发酵产物的提取与分离

第6章发酵产物的提取与精制发酵液下游加工是指从发酵产物中分离、纯化产品的过程，是利用产物和杂质的物理化学性质不同提取产物或者从系统中去除杂质的操作。6.1概述1．发酵液的一般特性（1）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。（2）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代谢副产物、残留培养基、无机盐等。（3）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。（4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件下易失活或分解。2．提取和精制提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量标淮要求的发酵成品。发酵产物存在形式不同，用途各异，产品质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处理和菌体分离、提取、精制、成品加工。

发酵产品后处理过程流程图发酵液预处理和菌体分离是采用凝聚和絮凝等技术，加速固液分离，提高过滤速度。如果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分离细胞碎片。初次纯化即提取，主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，浓缩产物，提高产品质量。常用方法有沉淀、吸附、萃取等。高度纯化即精制，采用对产品有高度选样性的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂质。典型的方法有层析、离子交换等。成品加工是为了获得质量合格的产品，常用浓缩、结晶、干燥等技术方法。6.2发酵液的预处理及菌体分离发酵液预处理及菌体分离是下游加工的第一步操作。目的是改善发酵液的性质，去除部分可溶性杂质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利于提取和精制工序的操作。预处理中常用酸化、加热、加絮凝剂、过滤、离心等方法。1．发酵液的预处理杂质直接影响产品质量和收得率，对提取和精制也有很大影响，特别是高价无机离子和杂蛋白等。高价无机离子会影响树脂对生化物质的交换容量。杂蛋白降低树脂的交换容量和吸附能力，溶剂萃取时引起乳化，堵塞过滤介质，或使滤膜受到污染。（1）高价无机离子的去除：发酵液中主要的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+等。钙离子常使用草酸（草酸钠）去除。Mg2+可加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。F3+离用黄血盐反应生成普鲁士监沉淀除去。（2）杂蛋白的去除：①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀，或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进行沉淀。②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶剂变性等。③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。（3）色素及其他物质的去除常用的脱色方法有离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等材料吸附。2．离心过滤与菌体分离菌体分离通常采用离心分离和过滤两种方法。离心分离是在离心力场的作用下，将悬浮液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒较小的悬俘液和乳浊液的分离。离心方法有差级离心法、密度梯度离心、等密度离心、平衡等密度离心。细菌和酵母菌发酵液多采用离心分离。霉菌和放线菌多采用过滤分离。过滤的原理是悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。根据机理，过滤可分为澄清过滤和滤饼过滤。澄清过滤中，过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时，固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以澄清。滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。（1）影响发酵液过滤的因素发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速度慢。过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期等有关。（2）改善发酵液过滤性能的方法发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。①调pH：除去蛋白质等两性物质，改变易吸附分子的电荷性质，减少滤膜堵塞和污染。②凝聚与絮凝：形成较大絮团，减少堵塞。③吸附剂法：将细菌吸附在吸附剂上，形成较大的颗粒，减少堵塞。④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速度。⑤反应剂法：3．细胞破碎与分离微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首先要收集菌体，进行细胞破碎。（1）微生物细胞壁的组成与结构：①细菌细胞壁：②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。（2）常用的细胞破碎方法细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、X-press法；后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法等。①机械法：高压匀浆法是利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，造成细胞破碎；X-press法或Hughespress法是一种改进的高压法，其操作方法是将浓缩的菌体悬浮液冷冻至-25℃~-30℃形成冰晶，利用500Mpa以上的高压冲击，将冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。由于冰晶体的磨损，造成包埋在冰晶体中的微生物变形而引起细胞破碎。此方法适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低，活性保留率高。但是不能用于对冷冻融解敏感的生物物质。

超声波法是利用超声波的空穴作用使细胞破碎，由于这种空穴泡又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由此引起的黏滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎。超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，所以操作时可以在细胞悬浮液中投入冰块或在夹层中通人冷却水进行冷却。②非机械法：酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁成分的特殊化学键，达到使细胞破碎的目的。分为外加酶法和自溶法（常采用加热或干燥法）。渗透压冲击法是将细胞先放入高渗透压的介质中，在达到平衡后，介质被突然稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂。反复冻融法是将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，最后引起细胞破碎。低温冷冻使细胞膜的疏水键结构断裂，增加细胞亲水性能；同时胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。可采用此法处理细胞壁较脆弱的菌体，但通常破碎率较低，有时即使反复如此处理仍不能提高破碎率。此外还可能引起对冻融敏感的蛋白质变性。干燥法可采用空气于燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。干燥过程能使细胞膜渗透性改变，再用丙酮、丁醇或缓冲液等处理时，胞内物质就容易被抽提出来。（3）细胞碎片的分离：常用离心分离法。近年来利用双水相萃取法，使生物大分子或细胞碎片在两相或多相中进行不同的分配，达到分离的目的。另外，向细胞碎片悬浊液中加入某种固体吸附剂，或使悬浮液通过装有吸附剂的固定床，也可达到去除细胞碎片的目的。6.3发酵产物的提取和精制1．沉淀法是通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。沉淀法浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段。沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点，不足之处在于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。（1）等电点沉淀法：利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理进行分离纯化。在低离子强度下，调节至等电点，可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解度。不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。等电点沉淀法优点是许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内，而许多无机酸价格低廉，并能为食品标准允许，因此常可无须除掉残余的酸，而直接进行下一步纯化操作。其主要的缺点是酸化时，容易引起蛋白质失活。不少蛋白质与金属结合后等电点会发生偏移。（2）盐酸盐法：在发解液中加入盐酸，使氨基酸成为氨基酸盐酸盐析出，再加碱中和到氨基酸的等电点，使氨基酸沉淀析出。（3）金属盐法：在发酵液中加入重金属盐，使难溶的氨基酸金属盐沉淀析出。沉淀经溶解后，调pH值至氨基酸等电点，使氨基酸沉淀析出。①等电点——锌盐法：谷氨酸与硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，生成谷氨酸锌盐沉淀。②钙盐法提取谷氨酸：

等电点锌盐法钙盐法提取谷氨酸工艺流程（4）有机溶剂沉淀法：许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。这种沉淀作用主要是由于水溶液介电常数降低、静电引力增大，带电溶质互相吸引凝集。具有水化层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使得这些分子脱水而相互聚集析出。有机溶剂沉淀法的优点是分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；而且有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，因此适用于食品、药品的制备。其缺点是容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。盐析法：在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐后，盐离子在水中发生水化，使蛋白质脱去水化膜层，暴露出琉水区域，疏水区域相互作用使蛋白质沉淀；同时中性盐的解离，中和蛋白质所带电荷，使蛋白质分子间排斥作用减弱而相互聚集。中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，生产上常用硫酸铵。其优点是成本低、操作简单、安全和对许多生物活性物质具有稳定作用。

（6）非离子型多聚物沉淀：可用于选择性沉淀从而纯化蛋白质，应用最多的是聚乙二醇(PEG)。作用机制有几种假设：多聚物与有机溶剂相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大分子形成复合物，发生共沉淀作用等。非离子型多聚物沉淀法操作条件温和，不易引起生物大分子变性，沉淀效果好，沉淀后的多聚物容易除去，广泛应用于核酸、蛋白质、细菌和病毒等的分离纯化。2．膜分离技术其实质是物质通过膜的传递速度不同而得到分离。其优点是：过程一般较简单，操作方便，费用较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能又特别适用于热敏性物质的分离纯化。（1）膜分离技术分类①透析：是利用膜两侧浓度差，使溶质从浓度高的一侧，通过膜孔扩散到浓度低的一侧，从而实现分离的过程。②电渗析：是一种以电位差为推动力，利用离子交换膜选择性地使阴离子或阳离子通过的性质，达到从溶液中分离电解质目的的膜分离操作。③微滤：微孔过滤，利用孔径0.025μm~14μm的多孔膜，过滤含有微粒的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通常为0.1MPa~0.5MPa。④超滤：滤膜孔径为lnm~20nm，用于过滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为推动力，通常为0.1MPa~0.6MPa。⑤反渗透：用反渗透膜(孔径0.1nm~1nm)，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜，截留所有可溶物而得到分离的操作。反渗透也是以压力差为推动力，操作压达3MPa~10MPa。⑥纳米过滤：以压力是为推动力，用纳米过滤膜(孔径约2nm)，从溶液中分离出相对分子质量300~1000的物质的膜分离过程。特点是：在过滤分离过程中，能截留小分子有机物，同时透析出盐，达到浓缩和透析目的；操作压力低，节约动力。（2）离子交换膜电渗析法：是利用可解离基团，在外加电场作用下，经有选择透过性的高分子膜，使各种带电性物质分离的技术。膜的种类很多，根据结构可分为非均相、半均相和均相离子交换膜；按作用可分为阳离子交换膜、阴离子交换膜和具有特种性能的离子交换膜；根据应用可分为电渗透浓缩用膜、电渗透脱盐用膜、电解隔膜、对特定离子具有选择透过性的离子交换膜、扩散渗透用离子交换膜、反渗透用离子交换膜。利用离子交换膜的选择透过性，进行抗生素、柠檬酸和氨基酸等产物的提纯。工业用离子交换膜应具备离子透过性高，导电性好，电解质扩散量小，水迁移量小，有一定机械强度，化学稳定性好，膜结构均匀一致，表面光洁，膨胀性小，价格便宜等特点。3．萃取法萃取是将某种溶剂加入到液体混合物中，根据混合物中不同组分在溶剂中溶解度的不同，将所需要的组分分离出来。液-液萃取也称溶剂萃取，其优点是：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快，比蒸馏法能耗低，生产能力大，周期短，便于连续操作，容易实现自动化控制等。（1）溶剂萃取：是利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，从料液中提取出来的物质称为溶质，用来进行萃取的溶剂称为萃取剂，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液为萃取液，而被萃取出溶质的料液称为萃余液。萃取步骤包括：混合→分离→回收溶剂。萃取操作流程分为单级萃取和多级萃取，多级萃取又分为多级错流萃取和多级逆流萃取①单级萃取：只使用一个混合器和一个分离器的萃取。流程最简单，单收率不高。②多级错流萃取：每级都加入新鲜萃取溶剂，溶剂消耗多，萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。③多级逆流萃取：料液走向与萃取走向相反，萃取剂只在最后一级加入，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。多级错流萃取（F料液；S溶剂；L萃取液；R萃余液；）多级逆流萃取乳化和去乳化：乳化是一种液体分散在另一种不相混溶液体中的现象。造成乳化的原因主要是蛋白质的存在。破坏乳浊液的方法有：过滤、离心分离、加热、稀释法、吸附法、加电解质等。

（2）超临界流体萃取：是将超临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某些高沸点或热敏性成分，达到分离和提纯目的。超临界流体是物质处于临界温度、临界压力之上的一种流体状态，兼有气体、液体两重性的特点，即密度接近液体，而黏度和扩散系数与气体相似。因此它不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有传质扩散速度快的优点。

超临界流体萃取中，主要是溶剂(超临界流体状态)密度的大幅度增加，导致溶剂对溶质的作用力增大，从而形成了溶解物质的能力。在临界点附近，压力或温度的变化会引起超临界流体密度的大幅度变化，而溶剂萃取能力主要取决于其密度，因此，通过调节压力和温度，改变溶剂密度，进而改变其对物质的溶解能力。利用不同密度的溶剂对物质溶解能力的差异，实现萃取和分离的操作。其过程由萃取阶段与分离阶段组成。超临界萃取典型流程①等温法：等温条件下，萃取相减压、膨胀，溶质从分离槽下部取出。气体经压缩机加压后返回萃取槽。②等压法：等压条件下，萃取相加热、升温，气体和溶质分离。溶质从分离槽下部取出，气体冷却、压缩后回到萃取槽。③吸附法：溶质被分离槽中的吸附剂吸附，气体压缩后回到分离槽。等温法（T1=T2，P1＞P2）等压法（T1＜T2，P1=P2）吸附法（T1=T2，P1=P2）（3）双水相萃取：是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法，可用于分离和纯化酶、核酸、生长素、病毒、干扰素等。大多数亲水性聚合物水溶液与第二种亲水性聚合物混合，达到一定浓度时，会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。高聚物之间的不相溶性，使得它们无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向，在一定条件下，即能分为两相。聚合物与盐类溶液也能形成两相，这是由于盐析作用，如PEG与碱性磷酸盐或硫酸盐形成的两相。溶质在两水相间的分配主要由其表面性质所决定，通过在两相的选择性分配而得到分离。分配能力的大小可用分配系数K表示。分配系数与溶质的浓度和相体积比无关，主要取决于相系统的性质、被萃取物质的表面性质和温度。4．树脂法离子交换技术是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异予以分离的技术。它所使用的离子交换剂是能和其他物质发生离子交换的物质，分为无机离子交换剂和有机离子交换剂(离子交换树脂)。离子交换树脂法具有成本低、操作方便、设备简单、提炼效率高、节约大量有机溶剂等优点。（1）离子交换原理：具有一定孔隙度的高分子化合物，其亲水性质使溶剂分子扩散到树脂颗粒内部，它具有酸性或碱性功能团，能交换阳、阳离子。交换过程是：①离子吸附或扩散到树脂表面；②离子穿过树脂表面，吸附或扩散至树脂内部的活性中心；③离子与树脂中自由离子交换；④交换出来的离子从活性中心扩散到树脂表面；⑤离子再由树脂表面扩散至溶液中。（2）离子交换树脂的结构与分类

结构分为两部分，一部分是不能移动的、多价高分子基团，构成树脂的骨架，使树脂具有不溶解性和化学稳定的件质；另一部分是可移动离子，构成树脂的活性基团。根据树脂官能团的性质将其分为：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、选择性离子交换树脂、两性离子交换树脂、吸附树脂和电子交换树脂。①阳离子交换树脂：有强酸性（-SO3H）、中强酸性（-PO3H2、-HPO2H）、弱酸性（-COOH）。②阴离子交换树脂：有强碱性（-N(CH3)3）、弱碱性（-NH2、-NHR、-NR2）。③选择性离子交换树脂：又称螯合性离子交换树脂，与金属离子形成螯合物的基团，对某些离子具有特殊选择性的树脂。④两性离子交换树脂：同时含有酸性、碱性基团，有强碱-弱酸[-N(CH3)-COOH)]和弱碱-弱酸（NH2-COOH）。⑤吸附树脂：又称“脱色树脂”。有较大表面积，多孔性，吸附能力强，交换离子的能力很小。⑥电子交换树脂：又称氧化还原树脂。其作用是电子转移，起到氧化还原作用。（3）树脂和操作条件的选择：强碱性离子一般选用弱酸性树脂，如用强酸性树脂，会造成解吸困难。弱碱性离子宜用强酸性树脂，如果用弱酸性树脂，不易吸附。强酸性离子选用弱碱性树脂，弱酸性离子用强碱性树脂。如果要吸附大分子离子，选择交联度较低的树脂，以便大分子扩散到树脂内部。

操作条件需考虑：①pH满足在产物稳定范围内、产物离子化以及树脂能解离三个条件；②树脂类型：弱酸性和弱碱性树脂采用钠型或氯型；强酸性和强碱性树脂可采用任何类型。③产物浓度：低价离子浓度增加有利于交换上树脂，而高价离子稀释时